杨金来，吴良如，潘雁红,杨慧敏，钟 浩, 修诚明

(1.国家林业局竹子研究开发中心，浙江 杭州 310012； 2.浙江省竹子高效加工重点实验室，浙江 杭州 310012；3.福建6·18协同创新院竹产业(建瓯)分院，福建 建瓯 353100)

中国现有竹林面积 601 万hm2，以毛竹林为主(约占2/3)[1]，主要生长于福建、浙江、江西、湖南等省份[2]。毛竹林主要生产竹笋、竹叶和竹材等产品，其中竹笋和竹叶[3]富含蛋白，是一种潜在的天然可再生的绿色植物蛋白源。新鲜竹笋含水量约为90%，其蛋白含量高为1.49%～4.04%，平均值为2.65%，干物质蛋白含量非常丰富[4-5]。徐圣友等[6]分析了不同品种竹笋的蛋白质，其干物质含量为19.01%～30.66%，其中安徽皖南毛竹为19.01%。刘永等[7]提取了肇庆竹叶中的蛋白，其提取率为9.86%。因此，研究竹笋和竹叶蛋白情况对于其进一步高值化利用具有一定的指导意义。杭州余杭地区，其毛竹笋[8]共含有1 014个蛋白点，等电点主要集中在pH=6～7，相对分子质量主要集中在45～116 kDa；雷竹笋[9]仅含有812个蛋白点数，等电点集中于pH=9～10，相对分子质量集中于45～116 kDa。

竹笋好吃，但生吃有麻感，而建瓯市毛竹笋就可以生吃，因笋肉颜色比一般的毛竹笋肉白，当地人俗称白笋。建瓯市具有独特的气候环境和良好的土质，其毛竹粗大，生长出来的竹笋肉质鲜嫩、通体洁白、口感脆甜。因此，非常有必要进一步研究建瓯白笋的蛋白情况。研究以建瓯白笋及其竹叶(图1)为原料提取出总蛋白，并进行了总蛋白的双向电泳实验。

图1 建瓯白笋及其竹叶Fig.1 Jianou Bai Moso bamboo shoots and leaves

1 实验部分

1.1 材料与仪器

主要材料：建瓯白笋和竹叶(同1棵竹子)采自福建省建瓯市房道镇连地村；5 mg·mL-1牛血清(BSA)标准品(Sigma)；二硫苏糖醇(DTT)、溴酚蓝、丙烯酰胺、十二烷基磺酸钠、过硫酸铵、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(TEMED)、正丁醇、碘乙酰胺(IAA)、低熔点琼脂糖、普通琼脂糖、乙醇、冰醋酸、硫代硫酸钠、硝酸银、碳酸钠、甲醛、Na2EDTA·H2O等均为AR；Bradford 染液(595 nm)、Tris 饱和酚、RB 裂解液、PMSF(p0754)、蛋白提取缓冲液(500 mmol·L-1Tris-HCl，pH=8.65；50 mmol·L-1EDTA；100 mmol·L-1KCl；2 mmol·L-1DTT)等由上海生工提供；干胶条(24 cm，pH 3～10，GE)，IPG Buffer pH 3～10 (GE)，2D电泳样品提取缓冲液系列(上海生工，PL039)、2D Equilibration Buffer(上海生，SD6030)。

主要仪器：UV1800型分光光度仪(上海美谱达仪器有限公司)，等电聚焦仪(GE ETTAN IPGPHOR3)，DALT-SIX SDS-PAG电泳仪(GE Healthcare)，扫描仪(MICROTEK ScanMaker i800)等。

1.2 方法

1.2.1总蛋白提取与纯化 取1.5 g建瓯白笋(竹叶)充分液氮研磨后，转移到50 mL离心管，加入10 mL蛋白提取缓冲液，再加10 mL Tris饱和酚，充分振荡后于冰上保温，每隔5 min振荡1次，总共4次。然后4 ℃离心20 min(6 000 r·min-1)，将上层酚相转移至15 mL离心管中。在离心管中加入与酚相同体积的蛋白提取缓冲液，充分振荡后于冰上保温，每隔5 min振荡1次，总共6次，4℃离心30 min(5 000 r·min-1)，将上层酚相转移至15 mL离心管中。加入5倍酚体积的醋酸铵甲醇溶液对蛋白进行沉淀，充分振荡后置于冰上保温，每隔5 min振荡1次，总共6次，-20 ℃沉淀过夜。蛋白质离心30 min(4 ℃，5 000 r·min-1)，除去上清液，加入5 mL甲醇对蛋白进行洗涤，除去蛋白中的色素及盐，离心30 min (4 ℃，5 000 r·min-1)，再加入5 mL、4 mL丙酮对蛋白洗涤2次，离心20 min(4 ℃，12 000 r·min-1)后，溶解备用(竹笋蛋白3.0 mL，竹叶蛋白8.0 mL)。

1.2.2蛋白定量 以牛血清蛋白(BSA)为标准蛋白，采用Bradford法[10]测定建瓯白笋及其竹叶蛋白浓度并定量，用于双向电泳实验。

1.2.3双向电泳 量取一定体积的竹笋及其竹叶蛋白，保证上样量为1 200 μg，进行双向电泳实验[8-9]。

2 结果与讨论

2.1 蛋白定量

图2 BSA浓度与吸光度的线性关系Fig.2 The linear relationship between the absorbance and concentration of BSA

采用元素分析法测定新鲜建瓯白笋及其竹叶总蛋白，其含水量分别为90.49%和52.40%。将50℃烘干的竹笋片和竹叶分别粉碎成粉状用于元素分析测定，结果表明，干竹笋粉和竹叶粉的总蛋白含量分别为27.60%和14.60%，其新鲜建瓯白笋及其竹叶总蛋白含量分别为2.62%和6.95%。为了进一步得到建瓯白笋及其竹叶蛋白样品的浓度并定量，采用紫外分光光度法测定了2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5 mg·mL-1BSA溶液的吸光度(595 nm)，结果如图2所示。

由图2可知， BSA的浓度与吸光度值之间存在良好的线性关系，y=0.0235x+0.2785 (R2=0.9951)。因此，采用该方法对建瓯白笋及其竹叶蛋白样品的浓度进行了测定，结果如表1所示。由表1可知，4组建瓯白笋及其竹叶蛋白样品的吸光度测定的RSD值分别为0.84%和1.28%，测定结果重复性好，其吸光度的平均值分别为0.540和0.513。然后，由方程y=0.0235x+0.2785计算出竹笋和竹叶蛋白样品的浓度分别为11.13和9.98 mg·mL-1，提取量分别为33.4 mg和79.8 mg，提取率分别为2.23%和5.32%。因此。蛋白双向电泳实验所需上样量分别为107.8和120.2 μL。

表1 建瓯白笋及其竹叶蛋白样品的测定Tab.1 Determination on protein concentration of the Jianou Moso bamboo shoots and leaves

2.2 双向电泳

建瓯白笋及其竹叶总蛋白的双向电泳如图3和图4所示。由图3和图4可知，建瓯白笋总蛋白含有1 626个蛋白点，而竹叶总蛋白含有900个蛋白点。建瓯白笋为毛竹笋的1种，其蛋白点数明显高于杭州市余杭区的毛竹冬笋(1 014个)[8]和覆盖雷竹笋(812个)[9]。由图4A可知，在pH=5～7时，建瓯白笋及其竹叶蛋白点较多，分别为1 102个和589个，占总蛋白点的67.8%和65.4%，说明2种蛋白的等电点主要在pH=5～7。当pH<5时，建瓯白笋及其竹叶蛋白点仅为177个(10.9%)和168个(18.7%)，说明2种蛋白在该范围分布较少，其中在pH=4～5时，竹叶酸性蛋白点数(164)高于白笋(143)。当pH>7时，建瓯白笋及其竹叶蛋白点为347个(21.3%)和143个(15.9%)，说明建瓯白笋的碱性蛋白分布高于竹叶。由图4B可知，在分子量为35～45 kDa时，建瓯白笋及其竹叶蛋白点分布最为集中，分别达到382个(23.5%)和224个(24.9%)，明显高于杭州市余杭区的毛竹冬笋(88个)[8]。建瓯白笋及其竹叶蛋白的分子量主要分布在18～66 kDa，蛋白点个数分别为1 083(66.6%)和672(74.7%)，其它分子量范围分布相对较少。结果表明，建瓯白笋蛋白种类优于竹叶蛋白，建瓯白笋蛋白种类极其丰富(数量多于杭州余杭毛竹冬笋)。

图3 建瓯白笋(A)及其竹叶(B)总蛋白双向电泳图Fig.3 The 2-DE profile of total protein of Jianou Moso bamboo shoots (A) and leaves (B)

图4 建瓯白笋及其竹叶蛋白双向电泳凝胶中不同等电点(A)和相对分子质量(B)的蛋白点数Fig.4 The protein spots for different isoelectric point distribution (A) and various molecular mass (B) in 2-DE gel of Jianou Moso bamboo shoots and leaves

3 结论

以建瓯连地村同一颗毛竹的白笋和竹叶为研究对象提取总蛋白，采用Bradford法对蛋白样品进行了浓度测定(竹笋：11.13 mg·mL-1；竹叶：9.98 mg·mL-1)，并进行了双向电泳实验(pH=3～10)，其上样量分别为107.8和120.2 μL。

(1) 建瓯白笋含有1 626个蛋白点，明显多于杭州余杭毛竹冬笋(1 024个)和雷竹笋(812个)，且差异性较大，蛋白种类极其丰富；同时，竹叶的蛋白点数也高达900个；(2) 建瓯白笋及其竹叶的等电点主要集中在pH=5～7，含蛋白点分别为1 102个和589个，占总蛋白点数的67.8%和65.4%；其分子量主要分布在18～66 kDa，蛋白点数分别为1 083个和672个，占总蛋白点数的66.6%和74.7%。

建瓯白笋(毛竹笋)及其竹叶在天然植物蛋白利用方面具有潜在的应用前景。