徐立国 方换男 肖云峰 王汝法 刘爱新 李现道 刘春菊

摘要：本试验以山东潍坊烟田土壤为研究对象，对其根际溶磷解钾细菌进行筛选鉴定并分析该类细菌对烟草生长的影响。结果显示：（1）从山东潍坊烟田土壤样品分离得到34个细菌分离物。以烟草黑胫病菌（Phytophthora parasitica）和烟草青枯病菌（Ralstonia solanacearum）为指示菌，筛选出对2种病原菌有良好拮抗效果的菌株13株。（2）测定发现8株菌株具有良好的溶磷能力，菌株培养液中可溶性磷含量最高为241 mg/L。5株菌株具有解钾能力，菌株培养液中速效钾含量最高为13.95 mg/L。5株菌株具有产IAA能力，最高IAA产量为104.71 μg/mL。（3）菌株H1-2、3183可明显促进烟草生长，其浇灌后的烟草地上部和地下部鲜重均高于对照。（4）经16S rDNA序列系统进化分析得出，菌株3183和1441为贝莱思茅芽孢杆菌（Bacillus velezensis），菌株H1-2为多黏类芽孢杆菌（Peanibacillus polymyxa），菌株G2-7和D2为伯克霍尔德氏菌（Burkholderia spp.）。

关键词：烟草；植物根际促生菌；溶磷；解钾；鉴定

中图分类号：S572：S154.39文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）03-0107-06

Abstract In this experiment， the soil of Weifang tobacco field in Shandong was taken as the research object， the phosphate- and potassium- solubilizing bacteria in the rhizosphere were screened and identified and their effects on the growth of tobacco were analyzed. The results showed that 34 bacteria isolates were obtained from tobacco rhizosphere soil and 13 strains showed better antagonistic effects to both Phytophthora parasitica and Ralstonia solanacearum. The phosphate- and potassium- solubilizing capabilities of those isolates were tested， and 8 strains showed better phosphate-solubilizing activity and 5 strains showed potassium-solubilizing activity. The highest content of soluble phosphate and available potassium was 241 mg/L and 13.95 mg/L respectively. Five strains showed the activity to produce indole acetic acid （IAA） and the highest concentration of IAA was 104.71 μg/mL. H1-2 and 3183 strains could obviously promote the growth of tobacco. The aboveground and underground fresh weight of tobacco seedlings irrigating with these bacteria solution were both higher than those of control. Through comparison of the 16S ribosomal DNA and phylogenetic analysis， 3183 and 1441 strains belonged to Bacillus velezensis， H1-2 strain belonged to Peanibacillus polymyxa， and G2-7 and D2 strains belonged to Burkholderia spp. respectively.

Keywords Tobacco；Plant growth-promoting rhizobacteria；Phosphate solubilization；Potassium solubilization；Identification

植物根圍存在多种类型的微生物，可以通过溶磷、解钾和分泌植物激素等方式促进植物生长，同时也可通过竞争、拮抗作用和诱导植物抗病性来发挥防病作用[1]。因此，这类微生物在改善土壤微生态、促进植物生长和防治植物病害等方面具有重要潜力，常被称为植物根际促生菌（PGPR）[2]。已有多种PGPR菌株作为微生物肥料或用于植物病害生物防治并取得良好效果[2，3]。

山东烟区是连作多年的老烟区，长期连续栽培导致土壤养分失调、增产效应下降、多种病原菌在土壤中持续积累、烟草黑胫病和青枯病等土传病害逐年加重，对烟叶生产造成重大损失。针对上述问题，本研究从山东潍坊烟田土壤中筛选多株细菌菌株并对其溶磷、解钾及促生作用进行分析，以期为进一步开发应用该类微生物提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

5份供试土样采自潍坊烟区烟草根际土壤。供试烟草品种为NC89。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌菌株的分离 采用平板稀释法将土样进行稀释，参照文献[4]的方法对分离纯化的菌株进行抑菌活性测定。首先将纯化的菌株在NA[5]平板上划线，置于28℃恒温箱中培养24 h，刮取菌苔、用无菌水稀释至OD600为0.5，取10 μL菌悬液接于PDA[5]平板中心，28℃培养48 h，备用。

1.2.2 细菌菌株抑菌活性测定 对分离得到的菌株进行烟草黑胫病菌（Phytophthora parasitica）和青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）抑菌活性测定。烟草黑胫病菌抑菌活性测定方法：在待测细菌菌落两侧各接入一片病原菌丝块（直径5 mm），于28℃继续培养2～5 d后，测量抑菌圈直径[4]。青枯雷尔氏菌拮抗活性的测定采用菌悬液喷雾法，将浓度为1×106 cfu/mL的青枯雷尔氏菌菌悬液用微量喷雾器均匀喷在PDA平板上[4]。每处理重复3次。

1.2.3 细菌菌株溶磷能力测定 采用溶磷圈法检测各菌株的溶磷活性[6]。将各菌株制成菌悬液（OD600约为0.5），取10 μL点接于以Ca3（PO4）2为唯一磷源的PVK培养基中心，置于 28℃培养箱中培养 2～5 d 后，观察溶磷圈大小，根据菌落周围溶磷圈半径大小初步确定各菌株是否具有溶磷活性。每处理重复3次。

参照文献[6]的方法测定各菌株的溶磷能力。将显示溶磷活性的菌株接种于NBRIP培养液中，于28℃、180 r/min震荡培养，间隔24 h取样，共测5 d。将培养液离心去除菌体，取上清液稀释，后用钼锑抗比色法测定上清液中可溶性磷含量。以未接种菌株的培养液为对照。根据标准曲线[6]计算可溶性磷含量。

1.2.4 细菌菌株解钾能力测定 参照文献[7]的方法检测各菌株的解钾活性。取各菌株菌悬液（OD600约0.5）10 μL点接在以钾长石粉为唯一钾源的培养基[8]上，28℃培养5 d，观察透明圈的有无和大小，确定是否具有解钾活性。每处理重复3次。

参照文献[8]的方法将显示解钾活性的菌株接种到硅酸盐培养基中28℃振荡培养，分别于48、72、96、120 h取样，10 000 r/min离心15 min除去菌体和残渣，取上清液用火焰光度计测不同培养时间速效钾含量。每处理重復3次。同样以未接种菌株的培养液为对照。根据标准曲线[9]计算速效钾含量。

1.2.5 IAA定量测定 按照文献[10]的方法测定不同菌株IAA产量：取OD600为0.5的菌株菌悬液100 μL加入到含有L-色氨酸（1 000 mg/L）的LB液体培养基[8]中，28℃、180 r/min 振荡培养，分别于不同时间吸取1 mL的菌悬液至1.5 mL离心管，离心去除菌体，取800 μL上清液至无菌的10 mL离心管，同时加1 600 μL Salkowski比色液，以无菌水为对照。室温、避光放置25 min 后，分光光度计测定反应液在540 nm 的吸光值，根据IAA标准曲线[9]比较不同菌株在不同时间的IAA产量。每菌株3次重复。

1.2.6 细菌菌株对烟草幼苗的促生作用 挑取不同菌株分别于NA培养基28℃下培养48 h，用无菌水收集菌体、调节菌悬液浓度至1×108 cfu/mL备用。将菌悬液灌根处理5—6叶期的烟苗，以等量无菌水灌根为对照。每棵烟苗用量为50 mL，每处理10棵烟苗，间隔7 d处理1次，共处理3次。于末次处理后7 d观察记录幼苗生长情况、株高、地上部和地下部鲜重等指标。

1.2.7 细菌菌株的鉴定 随机选择部分细菌菌株分别在LB培养液中培养 48 h，离心收集菌体。使用MiniBEST Bacterial gDNA试剂盒（TaKaRa）提取细菌基因组DNA，后对其DNA用通用引物（27F/1492R，27F：5′- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）进行16S rRNA扩增，PCR产物回收、测序后，与GenBank中已报道的相同基因进行对比分析，用分析软件DNAMAN v5.2.2进行序列同源性分析，MEGA 5.0进行系统进化分析。

2 结果与分析

2.1 细菌菌株的分离和抑菌活性

从烟草根系土壤分离获得34个细菌分离物，经平板对峙培养，发现13株细菌菌株对烟草黑胫病菌和青枯雷尔氏菌表现出较好的抑菌活性，抑菌圈直径均在1.2 cm以上。其中，菌株D2和G2-7对黑胫病菌的抑菌半径分别为1.4、1.5 cm，菌株3183和G2-7对青枯雷尔氏菌的抑菌半径分别为1.8 、2.0 cm ，可见这些菌株对烟草青枯病菌和黑胫病菌有较好的抑制作用。部分菌株的抑菌作用见图1。

2.2 细菌菌株溶磷能力分析

13株有抑菌活性的细菌菌株经PVK培养基培养后，有 8株菌株在培养基上可产生明显的溶磷圈。培养5 d后溶磷圈直径大于2.0 cm的菌株有6株，最大直径在4.7 cm，部分菌株的溶磷效果见图2。

从8株溶磷菌株中选择4株菌株对其溶磷能力进行定量测定，发现各菌株培养48 h后菌株培养液中可溶性磷含量最高。菌株G2-7、D2培养液中可溶性磷最高含量可达226、241 mg/L，菌株T11、T14-1分别为113.3 、118.2 mg/L（图3）。

2.3 细菌菌株解钾能力测定

13株有抑菌活性的细菌菌株中有5株可形成明显的透明圈，其中4株细菌菌株的解钾效果见图4，表明这些菌株具有溶解钾的能力。定量测定发现，菌株H1-2、1441解钾活性较好，菌液中速效钾含量分别为11.2～13.76、10.61～13.95 mg/L，菌株3183为4.12～5.50 mg/L，解钾能力相对较弱（图5）。

2.4 部分细菌菌株产IAA能力测定

5株参试菌株均具有产生IAA的能力，其在96 h 产生IAA量如图6所示，可见菌株3183的IAA产生量最高，约为104.71 μg/mL，其次为菌株1441，产生量為 86.42 μg/mL，其余菌株的产生量相对较低。

2.5 部分细菌菌株对烟草幼苗的促生作用

经不同菌株处理后，烟草幼苗与对照差别明显，其中菌株H1-2、3183处理后烟草植株的地上部和地下部鲜重均有明显提高，地上部鲜重分别比对照增加28.98%、28.91%，地下部鲜重增加22.73%、44.78%（表1），最大叶片面积和株高也有明显增加。

2.6 部分细菌菌株16S rDNA序列分析

由图7可知，菌株3183、1441与Bacillus velezensis位于同一分支，表明这2株菌株与Bacillusvelezensis亲缘关系最近，为贝莱斯芽孢杆菌；菌株H1-2为多黏类芽孢杆菌（Peanibacillus polymyxa）；菌株G2-7、D2为伯克霍尔德氏菌（Burkholderia spp.）。

3 讨论与结论

磷（P）是植物生长发育所必须的大量元素，参与细胞多种生命活动，对植物生长发育具有重要作用。土壤中的无机磷常被Fe或Ca等金属离子结合、固定而不能被植物吸收利用，而土壤中的PGPR可将被固定的磷溶解、释放，提高植物对P的吸收和利用率[10-12]。Kaur等[13]研究发现，Pantoea cypripedii等细菌能够促进植株生长、提高玉米和小麦产量。Ren等[14]从杨树茎内分离的B. pyrrocinia JK-SH007不仅对杨树溃疡病有良好的防治效果，而且可以促进杨树幼苗生长。因而PGPR菌株作为生物肥料应用有很大潜力。

钾（K）作为大量元素之一，不但能促进烟草生长，而且对提高烟叶品质具有重要作用。据报道，土壤中90%～98%的钾以钾长石或云母等含钾矿物质形式存在，只有1%～2%的K可以被植物直接吸收利用[16]。研究发现，Bacillus spp.和Pseudomonas spp.等多种PGPR菌株具有解钾能力，对土壤中钾的释放起重要作用 [15-18]。本研究从烟草根围获得的B. velezensis、P.polymyxa和Burkholderia spp.等菌株也表现出较高的溶磷和解钾能力，菌株菌液中速效钾含量最高达到13.95 mg/L，与Zhang等报道的菌株解钾能力相当[19]，而有关这些菌株的解钾机理及应用等还需要进一步研究。

本研究从山东潍坊烟区分离获得对黑胫病菌、青枯雷尔氏菌有抑菌活性的细菌菌株13株，其中部分菌株能够溶磷、解钾、产生IAA。室内盆栽试验发现菌株H1-2、3183对烟草生长有明显的促进作用。16S rDNA序列分析和系统进化分析发现，所获得的菌株分别为Bacillus velezensis、Peanibacillus polymyxa 和Burkholderia spp.，其中溶磷菌株均为Burkholderia spp.。

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