王利彬 董爽爽 王灿国 程敦公 李豪圣 刘爱峰 宋健民 刘建军 刘成 张玉梅 穆平 赵振东 曹新有

摘要：本研究从黑麦中克隆了一个热激蛋白Hsp90基因，暂命名为ScHsp90-1，并对其序列进行分析。结果显示，该基因cDNA序列全长2 103 bp，共计编码700个氨基酸，蛋白质分子量约80.47 kD。序列同源性分析表明，ScHsp90-1与小麦、玉米、水稻等物种的热激蛋白同源性较高；进化树分析表明ScHsp90-1与小麦的TaHsp90亲缘关系最近。利用实时荧光定量PCR技术对其表达特性分析表明，ScHsp90-1对高温、低温、高盐、干旱等非生物胁迫均有响应，其可能是黑麦的一个胁迫相关基因。

关键词：黑麦；热激蛋白Hsp90；克隆；表达分析

中图分类号：S512.5：Q781文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）03-0001-05

Abstract In this study， a Hsp90 gene was isolated from rye， named ScHsp90-1.The full cDNA sequence of ScHsp90-1 is 2 103 bp， which encodes 700 amino acids with a predicted molecular mass of 80.47 kD. The sequence analysis showed that ScHsp90-1 had higher homology with that of wheat， maize and rice. The phylogenetic analysis indicated that ScHsp90-1 was especially similar to TaHsp90 from wheat. The real-time quantitative PCR analysis showed that ScHsp90-1 had response to high-temperature， cold， high-salt and drought treatments in rye. These results indicated that ScHsp90-1 gene might be a stress-related gene of rye.

Keywords Rye； Heat-shock protein Hsp90； Cloning； Expression analysis

在受到高溫或其他理化因素胁迫后，生物体内的热激蛋白（heat-shock protein， Hsp）会极速合成并积累，从而参与生物体内蛋白的折叠，防止体内蛋白聚合[1]。热激蛋白作为一类分子伴侣蛋白，根据其分子量大小可分为小分子量Hsps、Hsp60、Hsp70、Hsp90和Hsp110等不同家族。目前对Hsp90的研究相对较多，Hsp90家族在生物体内蛋白折叠、降解及各种条件下的生长发育等方面均起到了十分重要的作用；其底物蛋白也广泛参与了生物细胞信号的传导[2]。当生物遭受逆境胁迫时，Hsp90家族基因会迅速做出响应，发挥其保护作用，阻止相关蛋白变形或功能出现紊乱，进而维持生物的正常生长。

大量研究表明，Hsp90家族基因广泛参与植物对各类逆境胁迫的应答。拟南芥中7个Hsp90家族基因已经被成功克隆，其中AtHsp90.2、AtHsp90.3、AtHsp90.4的蛋白序列相似度达96%以上，功能也有一定的交叉重复[3]。有研究表明，在拟南芥植株中过表达AtHsp90.3，转基因植株对高钙离子浓度耐受能力增强，对高温及重金属离子的耐受性却变弱[4]；过表达AtHsp90.2、AtHsp90.5 和AtHsp90.7，转基因拟南芥植株对钙离子浓度的耐受性有所增强，但是对高盐和干旱的耐受能力却有所降低[5]。同时，在小麦和水稻上的研究证明，Hsp90在胁迫环境响应及抗病性中也具有非常重要的作用[6，7]。

黑麦作为小麦的近缘物种之一，有许多可利用的条锈病、腥黑穗病、白粉病等抗性基因，与产量相关的大穗、多小穗性状，较高的蛋白质含量等；并且耐低温、耐干旱、耐土壤酸性[8]。目前对黑麦DNA重复序列及遗传连锁图谱构建的研究相对较多，而对其优异基因的挖掘却较少。为此，我们利用构建的NTT系统及后差减剔除技术[9]，获得了黑麦热激蛋白Hsp90家族基因的EST序列，本试验在前期研究的基础上克隆到一个基因全长（GenBank accession no. JQ685506.1），暂定名为ScHsp90-1。对ScHsp90-1蛋白序列进行生物信息学分析，进一步明确该基因的序列特征；并通过实时荧光定量PCR技术，对ScHsp90-1基因的表达特性进行研究，明晰ScHsp90-1基因在高温、低温、高盐、干旱等逆境条件下的表达特性，为进一步明晰ScHsp90-1基因可能参与的调控网络奠定基础及为下一步应用于分子育种提供优良的候选基因。

1 材料与方法

1.1 植物材料与胁迫处理

将黑麦（AR132）幼苗25℃条件下培养10 d后分别进行不同胁迫处理：（1）干旱：将整株黑麦幼苗置于干燥滤纸上进行干旱处理；（2）低温：将培养的黑麦幼苗置于4℃培养箱中进行低温处理；（3）高温：将培养的黑麦幼苗置于42℃培养箱中进行高温处理；（4）高盐：将黑麦幼苗根系完全置于100 mmol/L NaCl溶液中进行高盐处理；25℃条件下恒温培养。所有处理分别处理0、1、2、5、12、24 h后取样，快速置于液氮中，-80℃超低温保存备用。

1.2 ScHsp90-1基因全长的获得及特性分析

用RNA提取试剂盒（天根公司，北京）提取黑麦整株RNA，利用AMV反转录酶进行反转录。根据我们前期NTT系统及后差减剔除技术获得的黑麦Hsp90家族基因的EST序列及网上拼接，设计全长引物进行扩增（F： 5′-GCCATGGCGACGGAGACC-3′； R： 5′-GCTTAGTCGACCTCCTCCATCTTGCT-3′）。反应体系50 μL：10×buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP mix 2 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，高保真Taq酶0.5 μL，ddH2O 38.5 μL。反应条件：95℃变性3 min；95℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，40个循环。对扩增产物纯化后，连接到pEasy载体上（全式金公司，北京），转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆进行测序，获得全长序列利用CLUSTAL X和MEGA 4.1软件进行分析。

1.3 ScHsp90-1基因表达特性分析

将经过干旱、高温、低温、高盐处理的黑麦整株cDNA稀释50倍为Real-time PCR 反应模板， 设计实时荧光定量PCR引物ScHsp90-1-F（5′-GACCGAGACCTTCGCCTTCC-3′）；ScHsp90-1-R（5′-TGGTCATGCCAATGCCGCTGTC-3′）。以Actin基因（ F： 5′-TACTCCCTCACAACAACC-3′； R： 5′-GCTCCTGCTCATAATCAA-3′） 為内参。根据RealMasterMix（SYBR Green）试剂盒（天根公司，北京）操作说明书，建立反应体系，每个样品设3个重复。反应体系：2×Mix 12.5 μL、正向引物 （10 μmol/L）0.5 μL、反向引物 （10 μmol/L） 0.5 μL、模板cDNA 5.0 μL、ddH2O 6.5 μL，共计25 μL 体系。反应程序： 95℃变性2 min；95℃变性20 s， 56℃退火30 s，68℃延伸30 s，40个循环。在ABI PRISM7000 实时定量PCR 仪上进行。采用2-△△CT算法[10]对结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 ScHsp90-1基因序列的获得及分析

以黑麦整株cDNA为模板，利用设计的全长引物，PCR扩增后电泳可见明显的扩增条带（图1），回收连接载体、转化、挑单克隆进行测序，结果表明，该基因全长2 103 bp，共计编码700个氨基酸，命名为ScHsp90-1。经网上序列分析（http：//www.bio-soft.net/sms/prot_mw.html），其蛋白质相对分子量为80.47 kD。与其它植物的热激蛋白氨基酸序列分析比对 （http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）表明，ScHsp90-1与小麦、水稻、玉米等物种的热激蛋白具有较高的同源性；进一步进化树分析（图2）表明，ScHsp90-1与小麦的TaHsp90亲缘关系比较近，与水稻亲缘关系仅次于小麦。可见，Hsp90类蛋白在长期的进化过程中具有较好的保守特性。

2.2 ScHsp90-1基因时空表达特性分析

根据实时荧光定量PCR结果（图3），在高温42℃处理1 h后， ScHsp90-1的基因表达量达到最高值，之后表达量又降低，在10 h时又增加，随后减少；4℃低温处理条件下，ScHsp90-1基因在24 h时诱导表达量最大；在干旱胁迫处理下，ScHsp90-1的表达量均低于未胁迫水平；经高盐处理后，ScHsp90-1表达量增加，处理1 h时达到最大值，后迅速下降且低于未处理水平。上述结果表明，ScHsp90-1基因可能对高温、低温、高盐等胁迫均具有一定的响应表达，而在高温胁迫条件下诱导表达最为强烈。

3 讨论与结论

Hsp90家族基因作为分子伴侣，是一类广泛存在于生物体中高度保守的胁迫蛋白，在生物体受到高温等胁迫时快速响应，其作用十分广泛且重要[11-14]。作为分子伴侣，其可以保护细胞分子蛋白免受伤害，同时折叠已损坏的蛋白；还在植物的发育与进化、细胞信号传递、植物抗病性和遗传隔离中具有十分重要的作用[15，16]。

随着植物中大量Hsp90家族基因不断被挖掘与克隆，对其氨基酸序列比对发现，植物中的Hsp90与动物或酵母中的Hsp90 约有63%～71%的同源性；而在植物物种间，Hsp90的同源性高达90%左右[17]。本研究进化树分析表明，ScHsp90-1与TaHsp90亲缘关系最近，与其他植物的热激蛋白序列也有较高的同源性。由此可见Hsp90家族在植物长期进化过程中的作用应该比较重要，进而在不同植物中保持序列的高度保守。

Hsp90同时受多种生物或非生物逆境胁迫的诱导表达。有研究表明，水稻在遭受低温、高盐、干旱及ABA诱导后，体内的Hsp90基因表达量显著增加[7]；拟南芥中，Hsp90基因在重金属、高盐或高温逆境胁迫条件下，其表达量也有明显增加[18]。本试验表明，ScHsp90-1基因受低温、高温、干旱和高盐逆境胁迫的诱导表达，但在不同的逆境胁迫条件下，其表达模式不尽相同。其在高温胁迫条件下诱导表达最为强烈，而在干旱胁迫下表达量最低。然而，这种高度保守的Hsp90家族基因在不同植物中多个或单个核苷酸的变化是否具有一定的规律，以及其对各种胁迫的响应及作用机制，都可能是我们下一步研究的重要内容。

参 考 文 献：

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