鲁 坤, 曹永红

(1.陇南市林业局，甘肃 陇南 746000；2.陇南市经济林研究院花椒研究所，甘肃 陇南 746000)

花椒是指芸香科植物花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)和青椒(Zanthoxylum schinifoliumSieb.et Zucc.)的干燥成熟果皮[1]。花椒在我国的使用有着悠久的历史，作为一味传统中药材，具有温中散寒、除湿和杀虫止痛等作用；作为一种食用香辛料，被誉为“八大味”之一，也是川菜的主要调味品之一[2]。现代研究发现花椒最重要的用途是香辛料，用于食品的烹调加工调味，有赋香、着色、防腐、掩盖异味及增加食欲等作用[3]。

陇南地处亚热带向暖温带过渡气候区,境内高山、河谷、丘陵、川坝、盆地错落相间，海拔在550―4200m之间，年平均气温15℃，气候湿润、无霜期长、光热资源丰富。优越的气候特点，为花椒的发展提供了得天独厚的条件，所产陇南“大红袍”花椒以果皮丹红、粒大饱满、芳香浓郁、麻味醇厚而久负盛名[4]。

内生菌长期生活在植物体内特殊环境中并与之协同进化，在演化过程中形成了互惠关系，一方面，植物为内生菌提供其光合作用产物和矿物质以满足其生长必需的能量和营养需要；另一方面，内生菌通过自身代谢产物或借助于信号传导作用对宿主产生影响。甚至发现[5]内生菌不仅能参与植物次生代谢产物的合成、促进其生成、积累及对其的转化，还能独立产生与宿主相同或相类似的生物活性物质，是天然产物的重要来源。1993年美国蒙大拿州立大学Stierle[6]等首次报道从短叶红豆杉(Taxusbrevifolia)的韧皮部分离到一株能产生抗癌物质紫杉醇的内生真菌(Taxomycesandreanae)，掀起了在植物内生菌中寻找新物质的热潮，国内外相关研究报道很多[7―13]。但是，目前国内外对花椒的研究主要着眼于其生物性状与组织鉴别、化学成分分析[14]、药理研究[15]、相关产品加工应用[16]等方面，但对于花椒内生菌的研究较少，未见有关花椒枝叶片内生细菌物种多样性的报道。本研究通过对陇南花椒种植区样品的采集，对存在于花椒叶片中的内生细菌进行了分离和鉴定，旨在为花椒内生细菌(Endophytic bacteria)的综合开发利用提供参考，特别是在为利用花椒内生菌研制生物源农药方面提供直接依据。

1.材料和方法

1.1样品采集

从甘肃陇南各花椒种植区，参考平行线取样法[17]，采集健康和感病的4―8年树龄的花椒树枝叶片20份，共计360份，装入封口袋中，带回实验室放入4度冰箱备用。

1.2培养基

NA培养基：牛肉浸膏3.0g，蛋白脉10.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1000ml，pH值7.0。

1.3内生菌的分离

采用预实验中摸索的条件对样品进行表面消毒，即将采集的花椒叶片分别称重。将样品用自来水冲洗20分钟，用滤纸片吸取表面的水分；放入2%的次氯酸钠中表面消毒2分钟，用灭菌的滤纸片吸干表面的液体；再放入75%的酒精中灭菌3分钟，经过表面消毒的样品用无菌水漂洗3次，每次2分钟，再用无菌滤纸片吸干表面水分后用于内生菌的分离。验证样品表面消毒是否彻底，取第三次漂洗的水样200μl分别涂布于NA培养基平板中，用封口膜将平板封口后于32℃培养箱中培养3天，如果平板上没有长出菌落，证明消毒彻底。

在超净工作台内，将消毒彻底的样品放入无菌研钵中，加入10ml无菌水进行研磨，用无菌的两层擦镜纸进行过滤去除组织残渣，取1ml滤液用无菌水梯度稀释到10-3，取该稀释度的样品200μl，涂布到NA培养基平板上，每个样品3个重复，用封口膜将平板封口后放入32℃培养箱中培养3―5天，统计菌落数，再根据菌落大小、形态和颜色挑取和纯化内生细菌，对每一组样品，从培养基平板上纯化20株内生细菌。

1.4内生生防菌的系统发育分析

用细菌DNA提取试剂盒(BioTeke Co-poration，China，Cat#DP2001)按说明书提取细菌基因组DNA。以试剂盒提取的细菌基因组DNA为模板，采用通用引物27F(5'―AGAGTTTGATCCTGGCTCAG―3')和1492R (5'―GGTTACCTTGTTACGACTT―3')扩增 16S rRNA 基因。PCR反应体系(50μL):10×PCR buffer(2.5 mmol/L)5.0μL，10 mmol/L dNTPs(2.5 mmol/L)4.0μL，27F(10μmol/L)2.0μL，1492R(10μmol/L)2.0μL，TaqDNA聚合酶(5UμL―1)0.5μL，DNA 2.0μL，ddH20，34.5μL。PCR反应程序：95℃预变性10min，95℃变性1min，50℃退火1 min，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10 min。PCR扩增产物送北京华大基因科技股份有限公司测序。获得的DNA序列提交到GenBank核酸数据库。将测序获得的序列分别与GenBank上的序列进行BLAST相似性比较并下载与目标序列同源性最高的同源序列。将目标序列及其同源序列合并保存为单一的Fasta文件，多序列的比对排列依靠软件ClustalX[18]，并进行手工校对，再用Bioedit软件对比对结果进行手工调整以提高比对质量。分别采用MEGA(版本:6.06)软件包中的Kimura two―parameter矩阵模型和Neighbor―joining法进行亲缘距离的计算和系统发育树的构建，对Gap的处理采用Pair-wise Deletion。采用重抽样法(Bootstrapping)对分枝节点的置信度进行评价，Bootstrap抽样重复次数为1000次。

2.结果

2.1花椒叶片内生细菌生物量

本次实验中分离的到的花椒叶片内生细菌的数量为2.8×105CFU/g。

2.2花椒内生细菌的物种多样性

基于16S rRNA基因序列的系统发育分析表明，50株花椒内生细菌归属于厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)(表1,图1)。在分析的内生细菌中，属于壁厚菌门(Firmicutes)的种类在数量上占优势，共有42株株，占总数的84%。变形菌门有7株占总数的14%，放线菌门有1株，占总数的2%。

在厚壁菌门的42株菌株，属于6个属，19个种，其中芽孢杆菌属(Bacillusspp.)在数量上占优，共有36株，占该类群的85.70%。在芽孢杆菌属(Bacillusspp.)中共有13个种，B.timonensis和B.siamensis为优势种，分别有11株(占芽孢杆菌属菌株总数的30.56%)和8株(22.22%)，这些菌株与其近缘种的同源相似性分别为98.2―99.2%和99.79―99.93%，余下的17个菌株属于芽孢杆菌属(Bacillusspp.)的11个种(相似性98.05%―99.86%)，B.aryabhattai(3株)，B.altitudinis(3株)，B.safensis(2株)和B.velezensis(2株)，B.zhangzhouensis(1株)、B.subterraneus(1株)、B.oryzisoli(1株)、B.oceanisediminis(1株)、B.mesonae(1株)、B.depressus(1株)，B.atrophaeus(1株)；厚壁菌门(Firmicutes)的另外6个菌株中，1株属于Brevibacilluspanacihumi，1株属于B.formosus，1株属于Bacillussubtilissubsp.Inaquosorum1株属于Paenibacilluslautus1株属于Lysinibacillusmacroides1株属于Terribacillusaidingensis，相似性均大于98.56%。

共有6株内生菌属于变形菌门(Proteobacteria)，占总菌株的12%这些菌株分属于5个属5个种，2株属于Paracoccussanguinis(相似性99.92%)，1株属于Serratiamarcescenssubsp.marcescens(相似性99.93%)，1株属于Brevundimonasvesicularis(相似性99.70%)，1株属于Alcaligenesfaecalissubsp.faecalis(相似性99.93%)；1株属于Achromobacterspanius(相似性99.86%)。

共有1株内生菌属于放线菌门(Actinobacteria)，占总菌株的2%，属于Micrococcusendophyticus(相似性99.93%)。

3.讨论

植物内生菌在植物中无所不在，几乎在所有研究过的组织中均有分布[19]。植物内生菌有利于宿主植物，其中的一些种类也有利于人类，比如内生菌的细胞或代谢产物在在医药、农业及工业上的应用[20]。相对而言，内生菌比植物附生菌和土壤微生物在植物体内的生态位竞争上更占优势[21―23]，因此，内生菌常被认为是研发生物肥料和生防制剂的良好资源[19,22,24―26]。目前，很多植物种类的内生菌已被报道，但花椒树枝叶片内生细菌物种多样性的研究很少。本研究从花椒树枝叶片中分离得到5000株内生细菌，通过颜色、形态、生长量等指标，筛选出50株内生细菌，并对其种类多样性进行了分析。通过文献检索，本研究花椒内生细菌的多样性分析属首次报道。

本研究从花椒树枝叶片中分离内生细菌，以期得到花椒内生细菌的分布特征。Firmicute门的菌株出现频率最高，尤其是Bacillus属的菌株。芽孢杆菌(Bacillusspp.)在土壤、植物体内和水等生态环境作为优势种已被广泛报道[27―30]。

花椒作为甘肃陇南的主要经济林作物和当地农民的主要经济收入来源的特色产业。目前为止，未见针对花椒内生细菌物种多样性的研究报道，本研究分离得到花椒内生细菌26个种，为花椒内生菌物种多样性提供了科学的数据，也为开发利用内生菌防治花椒病害打下了坚实基础。