李红民，李冬民，步怀宇，徐敏，余源，陈富林

（1.西北大学 分子生物学课程组，西北大学 陕西省生物技术重点实验室，西北大学 西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室，陕西西安 710069；2.西安交通大学基础医学部，西安交通大学 生物化学与分子生物学系，陕西西安 710061）

限制性内切酶水解实验是生物学专业本科生必修的分子生物学实验基本内容之一，是从事生物学研究与工作必须掌握的基本技能。为了帮助学生利用一次简单实验学到更多的知识、培养更多的技能，笔者尝试将探究式教学用于限制性内切酶水解实验，通过设置情境问题、启发思考、调动讨论、课后思考与拓展阅读等环节，使学生在实验中获得足够多的知识信息。

1 研究对象

西北大学生命科学学院2014—2016年生物科学与生物科学基地班三年级本科生，每个实验班20～24人，其中生物科学基地班进行传统讲授教学、生物科学班进行探究学习。

2 教学内容与环节

2.1 教学内容

限制性内切酶水解实验是将选定的限制性内切酶、底物DNA（质粒DNA）、反应缓冲液等按照比例构建酶切反应体系，经过适当时间的酶切处理，通过琼脂糖凝胶电泳检测酶切作用后质粒DNA分子的变化[1]。

以传统讲授进行授课的生物科学基地班，其授课内容由限制性内切酶作用机理、限制酶的种类、命名与应用、酶的保存、移液器基本操作、仪器设备的使用、酶切体系的构建、实验注意事项以及实验结果观察与分析组成；以探究教学进行授课的生物科学班，其授课内容除传统教学内容外，增加围绕限制性内切酶作用结果分析、酶的选择（基因工程实际应用举例）、反应缓冲液的选择、限制性内切酶与遗传多态性分析等问题的情境讨论学习。

2.2 教学环节

教学环节由实验前传统讲授、学生进行实验操作、酶切处理期间进行探究学习以及实验结果观察与分析4部分组成。

3 教学环节的实施

3.1 传统讲授

实验开始之前，由教师与学生一起回顾理论课堂学习的相关知识，加深对限制性内切酶的定义、分类、命名以及酶作用特点的理解。结合生物化学中酶学理论知识，强调温度、离子条件、pH等对限制性内切酶催化活性和稳定性的影响以及控制这些条件的方法与途径。例如，离子条件、pH可以通过自行添加于反应体系或使用试剂供应商出售限制性内切酶时提供的反应缓冲液予以控制，而温度则可以使用恒温水浴或孵箱控制。强调实验注意事项，特别是非特异性核酸酶污染对实验结果产生的可能影响以及避免污染的途径。

3.2 学生独立实验

限制性内切酶水解实验的操作由微量酶切体系的构建、适当温度下保温酶切和琼脂糖凝胶电泳检测观察酶切结果三部分构成。操作过程中，由教师不断巡视、检查每个同学的基本操作，督促学生反复练习移液器的使用，熟悉培养箱、水浴锅、电泳槽等仪器的使用及注意事项。

3.3 探究学习

探究学习的关键与核心是设置问题情境，是教师引导学生探究学习的关键。围绕实验内容，设置难易适中的问题，以自由讨论的形式开展探究分析。在限制性内切酶水解实验中，针对实验目的，设置3个主要问题情境。

（1）关于限制性内切酶作用结果分析。面向本科生开设的限制性内切酶水解实验，通常采用质粒DNA样品，其相对分子质量和酶切位点已知。酶切处理混合物经琼脂糖凝胶电泳检测，可以发现DNA样品被酶水解后，产生了一些大小不等的片段，这就是酶切结果[2]。这样的酶切结果能够提供给实验者的信息是什么（作用结果分析）？围绕该问题情境，组织同学分组讨论，被探究的相关问题如下：①根据电泳结果，质粒DNA分子被单酶切水解产生了一个大小与质粒DNA一样的片段，说明质粒DNA中有几个该酶的切割位点？②如果产生2个大小不同、但2个片段的大小之和等于质粒DNA分子大小，说明质粒DNA分子中存在几个该酶的切割位点？③如果产生了1个片段，但其大小仅有质粒DNA分子大小的一半，说明质粒DNA分子大小存在几个该酶切割位点、切割位点之间的距离如何？④如果被作用的底物DNA分子是线状的，被单酶切、双酶切处理后，又会产生什么样的电泳结果？⑤同一种或者两种以上的酶作用于不同DNA样品，产生了相同的电泳图谱，从这样的水解结果又可以得到什么样的信息？⑥对于已知的共价闭合双链质粒DNA分子，若其中仅有一个限制性内切酶A的作用位点，被酶A作用后，产生几个片段？⑦当一种限制性内切酶作用于哺乳动物基因组时，会产生怎样的结果？⑧当双螺旋DNA变性为单链状态的DNA分子，是否还能被原本可作用的限制性内切酶切割？⑨反应体系中酶的用量是不是越多越好？讨论过程中，适时建议学生通过简单作图示意可能的酶切结果，并对结果进行分析，获得相应的信息。

（2）关于酶的选择（基因工程实际应用）。限制性内切酶发现以来，最主要的用途是在基因研究中对DNA分子进行人为的遗传操作，实现目的片段的克隆化、保存及充足的用于基因功能、外源表达等研究的材料。为实现基因操作的目的，如何选择添加在DNA片段上下游的酶切位点？围绕该问题情境，组织同学分组讨论，在教师的启发下，被探究的相关问题如下：①为什么要加酶切位点？②选择酶切位点时，要不要考虑载体中存在的酶切位点、选择什么样的酶切位点、选择的酶切位点是否会影响载体在宿主细胞中的复制、稳定性以及外源基因的表达效率？③选择酶切位点时，是否需要考虑被操作基因片段中存在的酶切位点，选择的标准是什么？④当把基因片段从克隆载体亚克隆到一个表达载体中时，是否可以直接通过酶切和连接重组实现，是否会有不妥，解决的方法有哪些？

（3）关于反应缓冲液的选择。限制性内切酶与其他蛋白质性质的酶一样，其催化活性需要合适的温度、离子条件、pH等环境条件以发挥最大催化活性[3]。启发同学讨论：当在同一反应体系中进行双酶切（基因工程常规操作）乃至三酶切时，上述条件怎样同时满足不同酶的最适作用条件、而温度条件又怎样满足？

探究学习结束时，通过即时考查巩固学习效果，鼓励有兴趣的学生积极开展课后拓展阅读，鼓励学生根据探究学习的收获自主分析实验结果。

4 探究学习的实践效果

探究式教学实践已在限制性内切酶水解实验中连续开展了3年，围绕酶切作用结果分析的情境问题讨论，可以很好地引导学生利用理论知识分析各种不同的酶切作用结果，并对实验并未涉及的酶切处理结果进行分析，明晰实验结果、结果分析和结论的区别，无形中提高学生独立分析实验结果、学以致用的能力；围绕酶的选择、缓冲液的选择的情境问题讨论，可以更好地帮助学生理解酶作为生物催化剂的高效性和作用条件对酶活性的影响，了解限制性内切酶的发现对于离体条件下进行基因操作的重要性，引导学生较好地学习进行基因功能研究、外源基因表达载体构建时选择可操作的限制性内切酶的一般原则、方法和技巧[4]。结合即时在线文献查阅和课后扩展阅读，使学生在实验中验证理论知识的同时拓展知识面，完全超越“进实验室、按步骤操作、看个实验结果、写个实验报告”的学习状态，切实提高独立操作、独立观察、独立思考、独立分析等实际能力。3年的实践教学显示，进行探究式教学的生物科学班学生中，能够比较熟练地解答考查问题和正确判读实验结果的学生比例大幅度升高，明显高于接受传统讲授的生物科学基地班（基地班的平均高考入学成绩高于生物科学班），而难以正确判读实验结果和难以解答问题的学生人数明显降低，这与其他学者的观察结果一致。

5 结语

探究学习在限制性内切酶水解实验中的教学实践表明，探究学习中的启发、思考、讨论等训练，能够开拓学生思路，显著提高多数学生的思维活跃度，将理论知识与实验现象、实验结果、问题解析等相联系，实现学以致用，切实提高本科生的科学素养和培养质量。

[1]Byrne A, McNeill J, Rogers K, et al. Impact of Enquiry Based Learning(EBL) on Student Midwife Praxis[J]. Midwifery,2018, 58: 83-85

[2]Yoon H, Joung YJ, Kim M. The Challenges of Science Inquiry Teaching for Pre-service Teachers in Elementary Classrooms: Difficulties on and under the scene[J]. Research in Science & Technological Education,2012,42(3)：589-608.

[3]Dobber M, Zwart R, Tanis M, et al. Literature Review: The Role of the Teacher in Inquiry-based Education[J]. Educational Research Review,2017,22:194-214.

[4]Meijerman I, Nab J, Koster AS. Designing and implementing an inquirybased undergraduate curriculum in pharmaceutical sciences. Currents in Pharmacy Teaching and Learning,2016,8:905-919.