单丽媛 ， 刘 龙 ， 李江华 ， 堵国成 *， 陈 坚

（1．江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；2.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡214122）

维生素 C（VC），又名 L-抗坏血酸（L-AA），是人体无法合成但却必需的营养元素[1]。在制药、食品、化妆品等行业有重要应用前景。由于VC很容易受到光照、热、金属离子等环境因素的影响而发生氧化反应，导致其本身化学结构极不稳定[2]。因此，寻找一种VC代替品能够行使VC功能的同时提高其稳定性具有重要意义。而2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸（AA-2G）作为VC的衍生物具有以下优点：稳定性强：AA-2G在水溶液中特别稳定，能抵抗各种氧化条件。具有较高的耐热性和抗氧化性[3-4]。安全性高：在各种VC糖基衍生物中，AA-2G没有细胞毒性，安全性最佳，并且没有直接还原性[5-7]。能保持VC的生物功能：在α-糖苷酶等酶的作用下AA-2G水解，逐步释放维生素C和葡萄糖，有效保护维生素C的生物活性[8]。生物合成容易：AA-2G可以通过生物酶法转化得到，操作过程简单、易于控制、污染少[9]。

环糊精糖基转移酶（CGTase，EC 2.4.1.19）属于糖基水解酶家族，被认为是催化合成AA-2G的最佳酶[10]。CGTase能够催化4种反应：水解反应，环化反应，耦合反应以及歧化反应[11]。CGTase通过歧化作用可以催化低聚糖和VC反应生成葡萄糖基维生素C[12]。

目前，α-环糊精和β-环糊精在CGTase催化合成AA-2G的过程中凭借它们较高的转化率，常被用作糖基供体[13]。张子臣[14]等利用β-环糊精作为糖基供体得到AA-2G的产量为9.76 g/L。日本林原生化和冈山大学[15]曾首次以α-环糊精作为糖基供体通过生物转化法合成AA-2G，AA-2G的纯度可达97%。Hong[13]等以环糊精为糖基供体利用从泡菜中获得的CGT酶转化合成AA-2G，最终得到AA-2G产量最高为2.98 g/L。但是，α-环糊精和β-环糊精这两种糖基供体同时也存在如下缺陷：α-环糊精价格比较昂贵，以此作为糖基供体时，生产成本比较高；β-环糊精虽然价格比α-环糊精低一些，但是β-环糊精在水溶液中的溶解度较低，经常以固体颗粒形式存在。所以，α-和β-环糊精均不具有大规模生产AA-2G的潜力[16]。因此，选择一种价格低廉又易溶的底物，代替α-和β-环糊精作为CGTase催化生产AA-2G的糖基供体，将会大大降低生产成本。

韩瑞枝[16]等通过对CGT与淀粉酶碳水化合物结合区域进行融合表达，以可溶性淀粉为底物最终得到AA-2G的最高产量为3.03 g/L。作者通过几种糖基供体的比较，选择具有较大优势的可溶性淀粉作为糖基供体。可溶性淀粉具有溶解度高、价格低廉等优势，在转化率、成本等各方面也都优于其它糖基供体。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 酶液来源 环糊精糖基转移酶（CGT-SL），酶活（α-环化活力）为476 U/mL：日本天野公司提供。1.1.2 主要试剂 VC：中国医药集团上海化学试剂公司产品；麦芽糊精：山东西王食品有限公司产品；β-环糊精：Sigma-Aldrich（上海）公司产品；AA-2G标准品：和光纯药工业株式会社（日本）产品；其它各种试剂均为国产分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 α-环化活力的测定 采用甲基橙法测定α-环化活力[17]。具体步骤为：0.9 mL 3 g/dL的可溶性淀粉溶液在40℃下预先保温10 min。将适当稀释的酶液 （对照用pH 6.0的磷酸缓冲液代替）0.1 mL加入到0.9 mL 3 g/dL的可溶性淀粉溶液中，在40℃下反应10 min，之后加入1.0 mL 1.0 mol/L盐酸停止反应。然后再加入1.0 mL 0.1 mmol/L甲基橙溶液显色，20℃条件下保温20 min，最后在505 nm下测定样品吸光度。一个酶活单位（U）定义为在上述条件下每分钟生成1 μmol/L α-环糊精所需的酶量[18]。作者所述酶活均为α-环化活力。

1.2.2 AA-2G合成反应的初始条件 反应体系：CGT-SL酶液2 mL（酶液适当稀释，终浓度为47.6 U/mL），糖基供体 0.5 mL（终质量浓度 10 g/L），维生素C 0.5 mL（终质量浓度10 g/L）。反应条件：初始pH 4.2，28℃，转速220 r/min，避光避氧条件下反应24 h[19]。

1.2.3 反应液样品处理方法 将反应结束后的反应液样品12 000 r/min离心10 min，然后用0.22 mm微孔过滤膜过滤。

1.2.4 AA-2G检测方法 高效液相色谱法[20]。色谱柱：Amethyst C18-H；检测器：Variable Wavelength Detector（UV）；检测波长：240 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL；流动相：V（KH2PO4）∶V（甲醇）=99.5∶0.5，用磷酸调pH至2.0。

2 结 果

2.1 转化产物的确定

为了对转化产物进行确定，对在初始反应条件下得到的转化反应液进行LC-MS鉴定。HPLC结果显示，转化反应液样品中在1.12 min出现峰 （图1B）和AA-2G标准样品出峰时间1.11 min（图1A）基本一致，初步判断为AA-2G。为了进行进一步确认，对AA-2G标准样品和转化液样品进行MS鉴定。AA-2G的相对分子质量为338.27。如图1D，转化反应样品 m/z=339.2（M+1）和 m/z=337.2（M-1），推断其相对分子质量为338.2，与标准样品MS（图1C）结果一致，可确定转化液样品中含有AA-2G。

图1 AA-2G标准样品及转化反应液LC-MS图Fig.1 LC/MS result of the biotransformation product and standard sample of AA-2G

2.2 糖基供体种类对CGT-SL转化合成AA-2G的影响

CGT酶可以利用多种寡聚糖合成AA-2G。为了找到合适的糖基供体作为CGT-SL转化合成AA-2G的底物，作者选取了6种不同的糖基供体来源：β-环糊精、麦芽糖、可溶性淀粉、玉米糊精、蔗糖及葡萄糖。如图2，该酶不能利用蔗糖和葡萄糖合成AA-2G。在初始反应条件下，β-环糊精和可溶性淀粉作为糖基供体时AA-2G的产量分别为1.24 g/L和1.23 g/L，明显优于其他糖基供体。考虑到可溶性淀粉与β-环糊精相比具有可溶性强、便宜易得等优点，作者选用可溶性淀粉作为糖基供体进行后续优化研究。

2.3 酶浓度对CGT-SL转化合成AA-2G的影响

酶浓度对AA-2G的产量有重要的影响。在初始反应条件下，以可溶性淀粉为糖基供体，考察不同的酶浓度对AA-2G产量的影响。如图3，随着酶浓度的增加，AA-2G的产量随之增加。当酶浓度达到79 U/mL时，AA-2G的产量最高，达到3.53 g/L。当酶浓度高于79 U/mL时，AA-2G的产量逐渐降低。所以，选择酶浓度为79 U/mL作为后续研究。

图2 糖基供体对CGT-SL转化合成AA-2G的影响Fig.2 Effect of different glycosyl donors on AA-2G production

图3 不同的加酶量对AA-2G产量的影响Fig.3 Influence of different enzyme concentrations on AA-2G production

2.4 底物质量浓度对CGT-SL转化合成AA-2G的影响

底物质量浓度对CGT-SL转化合成AA-2G有重要影响。在酶浓度为79 U/mL，其它条件和初始反应条件一致的情况下，考察不同的底物质量浓度对CGT-SL转化合成AA-2G的影响。如图4，随着底物质量浓度的不断增加，AA-2G的产量也随之增加。当底物质量浓度达到16 g/L时，AA-2G的产量达到最高4.36 g/L。当底物质量浓度超过16 g/L时，AA-2G的产量反而有下降趋势。所以选择底物质量浓度16 g/L进行后续条件优化研究。

图4 底物浓度对CGT-SL转化合成AA-2G的影响Fig.4 Effect of substrate concentration on synthesis of AA-2G

2.5 底物VC与可溶性淀粉的比例对CGT-SL转化合成AA-2G的影响

VC与可溶性淀粉的比例不同对AA-2G的产量有不同的影响。采用酶浓度为79 U/mL，其它条件和初始反应条件一致，考察VC与可溶性淀粉的质量比对CGT-SL转化合成AA-2G的影响。如图5，当VC与可溶性淀粉的比例为2∶4时，AA-2G的产量最高达到0.826 g/L，VC转化率为21.06%。当VC与可溶性淀粉的质量比为1∶5时，VC转化率为25.08%，高于VC与可溶性淀粉的比例为2∶4时VC的转化率。但AA-2G的产量只有0.48 g/L，较VC与可溶性淀粉的比例为2∶4低。所以，作者选择VC与淀粉的质量比为2∶4进行后续优化研究。

2.6 转化反应时间对CGT-SL转化合成AA-2G的影响

为了考察CGT-SL转化合成AA-2G的最适反应时间，选择酶浓度为79 U/mL，VC质量浓度为16 g/L，VC和淀粉的质量比为2∶4，转化温度为25℃进行转化时间优化。反应过程中分别在不同的时间取样检测AA-2G的含量。如图6，随着转化时间的延长，AA-2G的产量随之增加。当转化反应时间为32 h时，AA-2G的产量达到最高，为4.66 g/L。对应VC转化率为14.90%。当反应时间超过32 h时，AA-2G的产量反而略有下降。所以，作者选择转化时间为32 h进行后续研究。

图5 VC与可溶性淀粉的比例对CGT-SL转化合成AA-2G的影响Fig.5 Effect of substrate proportion on the synthesis of AA-2G

图6 转化反应时间对CGT-SL合成AA-2G的影响Fig.6 Effect of time on AA-2G synthesis

2.7 温度对CGT-SL转化合成AA-2G的影响

反应温度对CGT-SL转化合成AA-2G具有重要影响。选择酶浓度为79 U/mL，VC质量浓度为16 g/L，VC和淀粉的质量比为2∶4，反应时间为32 h进行转化温度优化。作者选取8个不同的温度，考察温度对CGT-SL转化合成AA-2G的影响。如图7，当反应温度为15℃时，AA-2G的产量为5.953 g/L，明显高于其它温度下的产量，VC转化率为19.05%。当温度低于或高于15℃时，AA-2G的产量明显下降。所以，作者选择转化反应温度为15℃。

图7 温度对CGT-SL转化合成AA-2G的影响Fig.7 Effect of temperature on AA-2G synthesis

2.8 反应初始pH对CGT-SL转化合成AA-2G的影响

不同的反应初始pH对CGT-SL转化合成AA-2G具有不同的影响，pH过高或过低都可能会造成CGT-SL酶活力损失甚至丧失，进而在转化反应中导致AA-2G的产量下降甚至完全没有。选择酶浓度为79 U/mL，VC质量浓度为16 g/L，VC和淀粉的质量比为2∶4，温度为15℃，反应时间为32 h，改变初始 pH （2.0、3.0、4.0、5.0、6.0）， 考察不同 pH 对CGT-SL转化合成AA-2G产量的影响。由图8可以看出，初始pH为4.0时，AA-2G的产量最高，达到6.23 g/L，VC转化率为19.93%。当初始pH低于或高于4.0时，AA-2G的产量有所下降。当初始pH超过6.0时，不再有AA-2G生成，可能是CGT-SL在超过pH 6.0的条件下已经完全失去活力。所以，选择最佳pH 4.0进行转化反应。

图8 pH对CGT-SL转化合成AA-2G的影响Fig.8 Effect of pH on AA-2G synthesis

2.9 正交试验设计

选取单因素优化中影响相对较大的因素：酶浓度、底物（VC）浓度、pH、温度 4个因素，以 AA-2G的产量为指标，选用L9（34）正交表进行正交试验，各水平因素见表1。

设计9组试验，各组试验结果及方差分析表见表2。由正交试验结果可知，最佳组合为：酶浓度79 U/mL，底物 VC为 14 g/L，pH 4.0，反应温度 20℃，得到AA-2G产量为6.20 g/L，与单因素组合优化的产量相比相差不大。

表1 各因素水平表Table 1 Level of various factors

表2 AA-2G产量正交试验结果Table 2 Orthogonal test and the production of AA-2G

3 结 语

作者利用日本田野公司提供的环糊精糖基转移酶（CGT-SL），通过几种不同的糖基供体（β-环糊精、麦芽糖、可溶性淀粉、玉米糊精、蔗糖及葡萄糖）比较研究，发现其不能利用葡萄糖和蔗糖。在初始反应条件下，β-环糊精和可溶性淀粉作为糖基供体，AA-2G的产量分别为1.24 g/L和1.23 g/L。相比于其他糖基供体具有较大优势。从节约成本、糖基供体的溶解度和产量方面考虑，作者最终选择可溶性淀粉作为糖基供体。以可溶性淀粉和VC为底物转化合成AA-2G，产物通过HPLC/LC-MS分析，确定了转化反应液中含有AA-2G。在初始反应条件下，CGT-SL利用可溶性淀粉和VC转化合成AA-2G的产量为1.23 g/L。通过转化条件优化确定了CGT-SL转化合成AA-2G的最佳反应条件：酶浓度为79 U/mL，VC质量浓度为16 g/L，底物VC和可溶性淀粉的质量比为2∶4，最适温度15℃，最适pH 4.0，转化反应时间32 h，最终AA-2G的产量达到6.23 g/L，VC转化率为19.93%。与初始条件下相比，AA-2G的产量提高了4.06倍。

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