吴玉静，曹先通，蔡国荣，肖秀娟，李芳飞，杨志超 综述，郑振中△ 审校

(1.南昌大学第一附属医院心血管内科 330006；2.南昌大学第一附属医院普通外科 330006)

细胞死亡是机体发育、清除衰老受损细胞、维持内环境稳态的一个重要过程，现公认的细胞死亡方式分为“程序性死亡”和坏死。 “程序性死亡”包括凋亡(apoptosis)和自噬(autophagy)，是细胞按照特定信号通路进行的主动、有序的调控过程。部分坏死在特定死亡进程中可以像凋亡一样，按照特定程序、由基因调控，这种死亡方式被命名为necroptosis[1]。

1 Necroptosis的提出

以往观点认为坏死是细胞进行的被动、无序的死亡方式，近年来深入探索发现凋亡和坏死在很多情况下共同存在，共同参与细胞死亡进程。necroptosis是一种caspase非依赖性的死亡方式，它的死亡进程更迅速，对机体的危害更大。由于caspase活性需要一定量ATP的支持，当细胞出现炎症、缺血损伤等情况时，能量代谢受到抑制，ATP生成不足导致caspase活性下降，机体沿necroptosis方向进展[2]。这种在凋亡受阻时由死亡受体、配基活化启动、受体相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein kinase 1,RIP1)/RIP3介导、能被Nec-1特异性抑制的一类细胞死亡方式称为necroptosis。此外发现necroptosis能被其特异性小分子抑制剂Nec-1抑制，在caspase-8缺陷的小鼠中使用凋亡特异性抑制剂z-VAD-fmk不能抑制necroptosis[3]。研究发现necroptosis介导的细胞死亡中，细胞中无凋亡小体，但可发现自噬小体，同时细胞可检测出损伤相关模式分子(damage-associated molecular pattern molecules,DAMPs)[4]。

2 Necroptosis的分子调控机制

2.1Necroptosis通路启动 necroptosis信号通路需要死亡受体(death receptor,DR)与配基结合启动，现发现主要有TNF-α/TNFR1肿瘤坏死因子-α/重组人1型肿瘤坏死因子受体、Fas配基(Fas-L)/Fas、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配基(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand,TRAIL)/TRAILR、细胞表面Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)及DNA依赖性IFN调节因子(DNA-dependent activator of IFN regulatory factors,DAI)，其中TNF-α/TNFR1是研究相对较清楚的启动因子[5]。

在细胞信号转导通路中，TNFR1的胞内段与沉默死亡结构域(silence of death domain,SODD)结合后构象改变，继而与TNFR1相关死亡结构域(TNFR1-associated death domain,TRADD)结合，招募RIP、TNF受体相关因子2/5(TNF receptor associated factor,TRAF 2/5)、凋亡抑制蛋白(cellular inhibitor of apoptosis proteins,cIAP1/2)、LUBAC复合体(linear ubiquitin chain assembly complex)形成TNFR复合体Ⅰ(complex Ⅰ)发挥生物学效应[6]。

2.2RIPs家族在necroptosis中的作用及机制 RIP是一类丝/苏氨酸蛋白激酶，共7个成员，该蛋白家族中含有一类高度保守的丝/苏氨酸激酶结构域。RIP1和RIP3与细胞凋亡和necroptosis关系密切，其中RIP1是Nec-1抑制necroptosis的靶向位点。

RIP1含671个氨基酸，既可诱导细胞凋亡、necroptosis，又在TNF-NF-κB介导的细胞生存通路中起关键作用。RIP1由3部分组成，N端是丝/苏氨酸激酶结构域(kinase domain,KD)，是RIPs家族成员共有的组成部分；中间是RIP同源结合基序(RIP family homotypic interaction motifs,RHIM)，C-端是与TRADD结合的死亡结构域(death domain,DD)。每个RIPs成员具有各自独特的C-端，这样的结构决定了它们具有不同的生物学功能，参与不同的信号转导机制。

RIP3由518个氨基酸组成，C-端不含死亡结构域，由RHIM组成，在RIPs家族中只有RIP1和RIP3含有RHIM结构，该结构域在necroptosis调控通路中具有十分重要的作用。研究证明RIP3能使caspase-8缺陷的小鼠胚胎致死，敲除RIP3后，necroptosis进程受阻，但RIP1介导的凋亡途径不受影响。necroptosis通路中RIP1与RIP3紧密结合形成RIP1-RIP3复合体(necrosome)并相互磷酸化是信号通路能够正常发生的关键，且此现象为necroptosis独有。此外RIP3下游信号分子混合系列蛋白激酶样结构域(mixed lineage kinase domain-like,MLKL)寡聚化和质膜转位可能是necroptosis通路进行的关键[7]。

2.3Necrosome在necroptosis中的调控作用及机制 TNFR复合体Ⅰ中RIP1泛素化是决定心肌细胞存活或死亡的关键，第377位赖氨酸是主要泛素化位点。当RIP1被多聚泛素化时，招募转化生长因子β激活激酶1(transforming growth factor-β activated kinase1,TAK1)、TAK结合蛋白2(TAK1-binding protein 2,TAB2)和TAB3,形成TAK1-TAB2-TAB3复合物，激活NF-κB通路介导细胞生存。在cIAPs与TAK1介导的细胞泛素化中，抑制或敲除cIAPs后RIP1泛素化受阻滞而呈现明显的去泛素化状态，引起心肌细胞走向凋亡或necroptosis[8]。在去泛素化酶cylindromatosis(CYLD)作用下，RIP1从TNFR复合体Ⅰ中解离释放到细胞质，招募caspase-8、Fas死亡结构域相关蛋白(Fas-associated protein via a death domain,FADD)和TRADD形成TNFR复合体Ⅱ(complex Ⅱ)，当TNFR复合体Ⅱ中caspase-8聚集活化后，形成TNFR复合体Ⅱa，启动经典外源性凋亡通路，同时caspase-8降解RIP1和RIP3，阻断necroptosis进程[9]。z-VAD-fmk抑制凋亡通路或敲除caspase-8，RIP1和RIP3降解受到抑制，RIP3通过C端RHIM与RIP1结合形成RIP1-RIP3 necrosome，necrosome磷酸化激活RIP3进一步促进necroptosis进行[10]。necrosome的形成及相互磷酸化在necroptosis通路中发挥十分重要作用，Nec-1靶向作用于RIP1，抑制necrosome的形成而阻断necroptosis进程。

2.4RIP1-RIP3-MLKL在necroptosis分子信号通路中的作用 necrosome如何激活下游信号通路，仍未完全研究清楚。研究发现，MLKL可能是RIP3激酶下游底物，necroptosis信号通路中的关键分子，此外还发现一种小分子物质necrosulfonamide，能够作用于MLKL的N-端，使N-端丧失功能[6]。有研究发现RIP3和MLKL具有典型的激酶折叠，MLKL通过AMP-PNP形成非活性构象与RIP3稳定结合，在RIP3-MLKL复合体中，RIP3与MLKL各自的C-端、N-端发生改变，RIP3发生αC螺旋和活性环的显著构象改变。MLKL的N端含有4螺旋结构域(four-helix bundle domain,4HBD)，是MLKL发挥效应的主要部分；C-端为激酶结构域，含有同源激酶序列蛋白，具有疏水性，二者通过2个α-4HBD连接，未被激活的MLKL在细胞质中以单体存在[11]。当RIP3第227位丝氨酸发生自磷酸化后，MLKL第357位苏氨酸/358位丝氨酸位点磷酸化，引起MLKL单体发生寡聚化，寡聚后的MLKL N-端结合磷脂酰肌醇磷脂(phosphatidylinositol phosphate lipids,PIPs),C-端结合线粒体特异性心磷脂(cardiolipin,CL),使细胞质中的MLKL聚集到质膜，引起质膜转位。MLKL单体寡聚化和质膜转位在necroptosis进程扮演重要角色，N-端4HBD是主要功能部分，扰乱N-端功能，MLKL质膜转位受到阻碍[12-13]。敲除MLKL后细胞对死亡敏感性下降，抑制PI(5)P或PI(4,5)P引起necroptosis进程受阻，但均不会影响凋亡通路进行。

MLKL发生质膜转位后如何诱导necroptosis的发生发展，现仍未完全阐述清楚。现有以下几种观点仍存在争论：(1)线粒体蛋白磷酸酶PGAM5(phosphoglycerate mutase family member 5，PGAM5)可能与necroptosis进程有关。MLKL与PGAM5可能是RIP3下游两个重要信号分子，MLKL激活引起PGAM5活化并磷酸化[14-16]。在Ca2+和活性氧(ROS)的作用下形成线粒体攻击复合物Ⅲ(mitochondrial attack complex,MAC)，同时激活动力相关蛋白Drp-1 (dynamin-related protein 1)引发线粒体裂解，线粒体裂解后ATP生成减少，引起细胞发生necroptosis，线粒体的断裂为推动早期necroptosis进程起到重要作用；此外Drp-1激活产生大量氧自由基，直接导致细胞膜破裂、细胞器肿胀崩解，细胞走向 necroptosis进程；(2)MLKL发生寡聚化引起质膜转位，细胞膜离子通道功能紊乱使膜内外离子平衡改变，引起细胞发生necroptosis[17]；(3)MLKL作为质膜上募集Ca2+和Na+通道的平台发挥推动necroptosis的作用；但近期XIA等[18]发现，MLKL形成一种新型阳离子通道，对Mg2+通透性强并且允许其优先通过，对Na+和K+通透性弱，但不通透Ca2+；(4)MLKL通过N-端与PIPs结合后募集到质膜上直接作为成孔复合体发挥作用[16,19]。

2.5RIP1-RIP3-钙/钙调素依赖的蛋白激酶Ⅱ(Ca2+-calmodulin-dependent protein kinase,CaMKⅡ)在necroptosis分子信号通路中的作用 不同于经典的RIP1-RIP3-MLKL信号通路介导的necroptosis，ZHANG等[20]发现，在心肌缺血再灌注或氧化应激中，RIP3直接磷酸化及间接氧化激活CaMKⅡ，通过PIP3-CaMKⅡ-线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)途径介导心肌细胞程序性坏死，引起心肌损伤、恶性心室重构和心力衰竭；敲除RIP3或抑制CaMKⅡ能够预防心肌缺氧和氧化应激引起的necroptosis,过表达RIP3促进necroptosis的发展。

3 Necroptosis与凋亡、自噬的关系

凋亡是一种caspase依赖性的细胞死亡方式，一直以来凋亡被认为是维持内环境稳态的经典死亡方式，当凋亡信号通路阻断时，necroptosis以一种替代的形式参与细胞死亡[21]。现阶段认为，necroptosis和凋亡是互补的信号通路，具有共同的启动分子、激酶和蛋白酶，通过TNFR或TLR启动，招募RIP1、FADD、TRADD形成复合体介导细胞死亡通路[22]。随着研究的深入，越来越多学者发现在很多疾病中necroptosis和凋亡共同参与细胞的死亡进程。敲除RIP3或MLKL阻断TNF-α诱导的necroptosis进程后，可以促进necroptosis向凋亡转换，但是当RIP1的活性被抑制，这种转换效果会减弱。使用zVAD-fmk抑制凋亡通路,caspase-8的活性被抑制，RIP1磷酸化进而促进凋亡向necroptosis的转换。

自噬是一种具有自我更新和自我保护机制的细胞死亡方式，能够调节细胞内成分的降解，对维持体内平衡起至关重要的作用。自噬可以通过降解细胞内过剩的蛋白质和受损的细胞器维持机体稳态，适度的自噬可保护细胞免受环境刺激的影响，但是当自噬被过度激活或抑制时，介导损伤性作用将导致疾病[23]。OBERST等[24]认为招募FASS与自噬体结合可以直接激活RIP1和RIP3。在TNF-α或饥饿状态下介导的自噬可以抑制necroptosis，敲除RIP1或用Nec-1可以抑制自噬信号通路的进程。这些结果显示，自噬本身可能并不会诱导细胞死亡，它可能是necroptosis的下游信号通路。然而部分研究者认为，自噬并不仅仅可以介导细胞生存，其本身也会诱导细胞死亡。OSBORN等[25]发现FADD缺陷的T细胞增殖介导的necroptosis并不会影响自噬，提示自噬并不是necroptosis通路中的一部分，自噬与necroptosis是两种完全独立的细胞死亡方式。因此对于自噬与necroptosis的关系，至今依然没有确切的定论。

截至目前，对于necroptosis与凋亡和自噬这3种细胞死亡方式之间的相互关系及具体的信号分子机制依然未阐述清楚，需要更多的研究来探索。

4 Necroptosis在心血管疾病中的研究进展

在鼠心肌缺血再灌注模型中发现，给予一定剂量Nec-1能够使缺血再灌注急性期的心肌损伤明显减小，慢性期心肌纤维化减弱，梗死灶体积与对照组相比明显缩小。在缺氧诱导的心肌缺血损伤中，使用抑制剂Nec-1，凋亡信号通路caspase-3表达相对增加；使用凋亡抑制剂z-VAD-fmk，necroptosis信号通路RIP3表达量增加。通过大量研究发现在急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)模型中凋亡占据了重要的地位，其中线粒体通路研究相对较充分，而TNF-α死亡受体通路证据较少。后期通过不断研究证实在大鼠AMI模型中有necroptosis信号通路RIP1、RIP3蛋白表达，提示心肌细胞的死亡方式不仅只有凋亡与自噬，necroptosis也发挥了作用，并且在一定条件下necroptosis与凋亡共同存在且相互转化。有文献报道在病毒性心肌炎(viral myocarditis,VMC)中发现了凋亡和自噬，但使用caspase抑制剂处理病毒感染的心肌细胞发现，心肌细胞的死亡进程加快，具体机制目前仍不清楚。

通过不断深入研究，necroptosis参与包括感染和炎症性疾病、动脉粥样硬化、脑缺血性疾病等疾病进程，近年来necroptosis在急性心肌缺血再灌注损伤及心力衰竭中的作用受到广泛重视，使用Nec-1能够明显减弱心肌损伤。在心肌炎或心瓣膜病等其他心血管疾病中是否也存在necroptosis?具体信号调控机制是什么?阻止进程能否保护心肌细胞?这些问题至今还没有确切定论。随着necroptosis研究的日益深入，其机制的探索也取得了一定进展，其将有望为研究心肌细胞坏死的病理机制、治疗方向及干预措施提供新的突破口。