李春明,刘藕根,彭亚婷,张淑兰,张颖鹏,刘志刚

(南昌大学第二附属医院，南昌 330006)

皮肤鳞状细胞癌(简称皮肤鳞癌)起源于表皮或附属器角质形成细胞，其发病率仅次于基底细胞癌[1,2]。近年来在视网膜和其他多种细胞、组织中发现了一种内源性的强效抗肿瘤蛋白，即色素上皮衍生因子(PEDF)，为临床治疗皮肤鳞癌提供了新的思路。目前发现，PEDF短肽同样具有生物学活性，较全长的PEDF蛋白更容易被载体携带且引起的不良反应更少。PEDF全长418个氨基酸(aa)，Abe等[3]发现该PEDF长肽片段(301～418 aa)可抑制人成骨肉瘤MG-63细胞增殖。2014年12月～2016年6月，本研究将该PEDF长肽片段(301～418 aa)人工合成更小的短肽分子(6～7 aa)，筛选出可抑制皮肤鳞癌细胞增殖的PEDF短肽，并检测其透皮性。现将结果报告如下。

1 材料

细胞：人皮肤鳞癌SCL-1细胞株购自深圳中洪博元生物技术有限公司。实验动物： BALB/c裸鼠9只，雌雄不限，4～6周龄，体质量16～22 g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。主要试剂：DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶均购自美国Gibco公司，乙二胺四乙酸(EDTA)购自上海生物工程有限公司，罗丹明标记亲合素(Avidin/RBITC)购自美国BD公司，CD31单抗购于美国Santa Cruz公司，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染料购自美国Sigma公司，FITC标记兔抗鼠二抗购自美国Jackson公司，CCK-8细胞增殖检测试剂盒购自日本株式会社同仁化学研究所，OCT包埋剂购自美国Sakura公司。主要仪器：二氧化碳培养箱购自美国Thermo公司，全波长酶标仪购自美国MD公司。

2 方法与结果

2.1 抑制皮肤鳞癌细胞增殖的18～20 aa短肽筛选

2.1.1 6个18～20 aa短肽合成 将PEDF长肽(301～418 aa)序列分成6段，人工合成6个18～20 aa长度的短肽，即P1(301～320 aa，氨基酸序列：aaidrelktvqavltvpklkls)、P2(321～340 aa，氨基酸序列：yegevtkslqemklqslfds)、P3(341～360 aa，氨基酸序列：pdfskitgkpikltqvehra)、P4(361～380 aa，氨基酸序列：gfewnedgagttpspglqpa)、P5(381～400 aa，氨基酸序列：hltfpldyhl nqpfifvlrd)、P6(401～418 aa，氨基酸序列：tdtgallfigkildprgp)。所有短肽由上海生工生物工程股份有限责任公司合成。

2.1.2 18～20 aa短肽筛选 将SCL-1细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基，于37 ℃、5% CO2恒温饱和湿度培养箱中进行培养，细胞融合至90%左右进行传代。取对数生长期的SCL-1细胞，用胰酶/EDTA消化后重悬于含10%胎牛血清的DMEM培养基中；调整细胞密度为5×104/mL，接种于96孔板，每孔100 μL。放置于孵箱中24 h，待细胞铺满孔底部60%～70%时，弃培养基，PBS冲洗2次。将细胞随机分为观察A组和对照A组，观察A组分别加入含有P1～P6(短肽浓度均为100 ng/mL)的无血清DMEM/0.5% BSA各100 μL，对照A组加入无血清DMEM/0.5% BSA 100 μL。采用CCK-8法检测两组细胞增殖能力(孵育23 h时每孔加入CCK-8溶液10 μL，继续孵育1 h。全波长酶标仪检测450 nm处的吸光度值，以此表示细胞增殖能力)，每种处理因素均设5个复孔，重复3次，取平均值。结果显示，加入P1～P6的观察A组细胞吸光度值分别为0.44±0.02、0.45±0.01、0.54±0.02、0.48±0.02、0.50±0.03、0.52±0.01，对照A组为0.52±0.02；加入P1、P2的观察A组细胞吸光度值明显低于对照A组(P<0.05或<0.01)，加入P3～P6的观察A组细胞吸光度值与对照A组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。证实P1、P2可抑制皮肤鳞癌细胞增殖。

2.2 抑制皮肤鳞癌细胞增殖的6～7 aa短肽筛选

2.2.1 6个6～7 aa短肽合成 将P1进一步分成3段，人工合成3个更小的6～7 aa短肽，即P1-1(301～307 aa，氨基酸序列：idrelkt)、P1-2(308～314 aa，氨基酸序列：vqavltv)、P1-3(315～320 aa，氨基酸序列：pklkls)。将P2进一步分成3段，合成3个更小的6～7 aa短肽，即P2-1(321～327 aa，氨基酸序列：yegevtk)、P2-2(328～334 aa，氨基酸序列：slemkl)、P2-3(335～340 aa，氨基酸序列：qslfds)。所有短肽由上海生物工程技术公司合成。

2.2.2 6～7 aa短肽筛选 参照2.1.2的方法进行细胞培养，将细胞随机分为观察B组和对照B组。观察B组分别加入含有P1-1、P1-2、P1-3、P2-1、P2-2、P2-3(短肽浓度均为100 ng/mL)的无血清DMEM/0.5% BSA各100 μL，对照B组加入无血清DMEM/0.5% BSA 100 μL。采用CCK-8法检测两组细胞增殖能力。结果显示，加入P1-1、P1-2、P1-3、P2-1、P2-2、P2-3的观察B组细胞吸光度值分别为0.44±0.02、0.45±0.01、0.55±0.03、0.54±0.02、0.38±0.02、0.52±0.02，对照B组为0.54±0.03；加入P1-1、P1-2、P2-2的观察B组细胞吸光度值明显低于对照B组(P均<0.01)，加入P1-3、P2-1、P2-3的观察B组细胞吸光度值与对照B组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。证实P1-1、P1-2和P2-2可抑制皮肤鳞癌细胞增殖。

2.3 P1-1、P1-2和P2-2短肽的透皮性分析 采用生物素标记P1-1、P1-2和P2-2短肽，在人工合成时给予其N端修饰生物素。将标记过的P1-1、P1-2和P2-2短肽分子用1 mmol/L PBS溶解，取70 μL外涂于裸鼠的局部皮肤。每次使用3只裸鼠，实验重复3次。2 h后，剥离短肽分子局部作用部位的裸鼠皮肤组织，采用免疫荧光法观察其透皮性。方法如下：将皮肤标本置于包埋剂OCT中，液氮保存，4 μm厚度连续切片，转移至准备好的盖玻片表面。4%多聚甲醛室温固定20 min，PBS洗3次，每次5 min；加入预热的10 mmol/L枸橼酸钠缓冲液，95 ℃ 加热20 min；PBS洗3次，每次5 min。用含0.1% Triton-100的PBS室温穿膜15 min，加入10%兔血清室温封闭1 min。在不同的盖玻片上分别滴加Avidin/RBITC及CD31单克隆抗体孵育4 h，PBS洗3次，每次5 min。加入罗丹明标记的兔抗鼠二抗(稀释比例为1∶40)，避光下室温孵育2 h，PBS洗3次，每次5 min。避光状态下加入1 μg/mL DAPI复染20 min，在荧光显微镜下观察并拍照。结果显示，经P1-1、P1-2、P2-2短肽外涂的裸鼠皮肤组织血管内及血管壁均可检测到红色荧光。证实P1-1、P1-2和P2-2短肽的透皮性均较好。

3 讨论

PEDF是一分子量为50 kD的内源性可溶性分泌蛋白，含有两个结构域，分别为N末端的神经营养区域和C末端的丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族反应环。PEDF由SERPINF1基因编码，该基因位于人的第17号染色体短臂1区3带中的1亚带(17p13.1)，由8个外显子和7个内含子组成。PEDF最初于1989年由Tombran-Tink从人胚胎视网膜色素上皮细胞分离而来，并证实其能够诱导视网膜上皮细胞分化。后来发现PEDF在人体广泛分布，例如在脑、脊髓、眼、心脏、血管、肝脏、骨组织以及外周血中均可以检测到PEDF表达[4]。在人体皮肤组织中，PEDF在表皮、真皮及皮肤附属器均有表达[5]。越来越多的研究证实，PEDF具有抗肿瘤、营养神经、保护神经、抗血管新生、调节免疫及脂质代谢等多种生物学功能[6,7]。

目前PEDF的抗肿瘤作用逐渐成为研究热点。Wagsater等[8]研究发现，PEDF在多种实体肿瘤和肿瘤细胞系中表达降低或无表达；冯子超等[9]发现，在皮肤基底细胞癌皮肤组织中PEDF表达明显低于正常组织，其认为可能此与皮肤基底细胞癌的发病密切相关。既往研究显示，PEDF表达降低和前列腺癌、胰腺癌、骨肉瘤、乳腺癌、神经母细胞瘤、黑色素瘤、神经胶质瘤等多种肿瘤侵袭能力升高及患者预后不良相关[10]。体内和体外实验证实，PEDF对前列腺癌、乳腺癌、子宫颈癌、胰腺癌、肺腺癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、骨肉瘤等多种肿瘤均发挥抗肿瘤作用[10～12]。目前认为，PEDF主要通过抗肿瘤血管新生、抑制肿瘤细胞增殖并促进其凋亡、抑制肿瘤细胞侵袭和转移发挥抗肿瘤作用[13]。

研究证实，PEDF短肽分子同样具有抗肿瘤作用。44短肽(78～121 aa)可与视网膜母细胞瘤Y-79细胞表面80 kDa蛋白结合，并诱导其向神经元分化[14]；44短肽(58～101 aa)及其片段(78～94 aa)均可降低细胞角蛋白K8表达，提高胃泌素释放肽mRNA表达，提示PEDF短肽可以诱导前列腺腺癌细胞神经内分泌分化[15]；25短肽(78～102 aa)有同样的促神经母细胞瘤和骨肉瘤分化活性，能够抑制骨肉瘤细胞增殖[16,17]。部分PEDF短肽参与调控肿瘤细胞外基质黏附，如25短肽(40～64 aa、78～102 aa和90～114 aa)可增加骨肉瘤细胞和Ⅰ型胶原黏附，25短肽(387～411 aa)可降低骨肉瘤细胞的侵袭能力[17]；PEDF可能通过活化Fas/FasL通路而发挥抗肿瘤作用，并诱导细胞G1期阻滞[18,19]。

基于上述研究结果，本研究推测PEDF短肽可能具有抗皮肤鳞癌作用。本研究首先发现18～20 aa PEDF短肽P1(301～320 aa)、P2(321～340 aa)可抑制SCL-1细胞增殖，提示P1、P2短肽片段存在抑制SCL-1细胞增殖的功能表位。随后本研究将P1分成3个更小的6～7 aa短肽片段P1-1(301～307aa)、P1-2(308～314 aa)和P1-3(315～320 aa)，P2分成3个更小的6～7 aa短肽片段P2-1(321～327 aa)，P2-2(328～334 aa)和P2-3(335～340 aa)，并证实P1-1、P1-2和P2-2可抑制SCL-1细胞增殖；提示成功筛选出可抑制皮肤鳞癌细胞增殖的6～7 aa PEDF短肽。

本研究在检测6～7 aa PEDF短肽皮肤透皮性实验中应用了生物素-亲和素系统标记技术。生物素广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄和肝组织中提取。亲和素亦称抗生物素蛋白、卵白素，是从卵白蛋白中提取的一种由4个相同亚基组成的碱性糖蛋白，分子量为68 kD，可耐受多种蛋白水解酶的作用，尤其是与生物素结合后，稳定性更好。每个亲和素能结合4个分子的生物素，二者之间的亲和力极强，亲和素结合生物素的亲和常数可为抗原-抗体反应的百万倍，二者结合形成复合物的解离常数很小，呈不可逆反应性。因此，生物素-亲和素系统在实际应用中的产物稳定性很高。本研究将6～7 aa PEDF短肽使用生物素标记，后者通过与罗丹明标记的亲合素结合，可发出红色荧光，便于检测PEDF短肽的表达及定位情况。虽然许多生物分子蛋白无法穿透正常表皮，但是小于1 kD的短肽分子却有可能穿透皮肤表皮。Abe等[3]筛选出类似的特异的低分子短肽(分子量< 850 Da)，体外实验证实其能够抑制血管新生，皮肤穿透性实验提示该短肽可以穿透至皮肤真皮层以及皮下血管。本研究人工合成的6～7 aa理论上分子量为720～540 Da，故推测这些短肽分子能穿透表皮到达真皮。本研究结果显示，经P1-1、P1-2、P2-2短肽外涂的裸鼠皮肤组织血管内及血管壁均可检测到红色荧光。证实6～7 aa短肽分子P1-1、P1-2、P2-2均可以穿透表皮到达真皮血管位置，透皮性较好。

综上所述，本研究成功筛选出可抑制皮肤鳞癌细胞增殖的6～7 aa PEDF短肽P1-1、P1-2、P2-2，其透皮性均较好，有望用于皮肤鳞癌的治疗。