司超，刘玮，刘俊，李霞斌，姚辉华,(西南医科大学临床医学院，四川泸州646000；成都市第一人民医院；西南医科大学附属医院)

慢性HBV感染是我国肝细胞癌(简称肝癌)的主要致病原因，HBV DNA编码的X蛋白(HBX)与HBV感染致癌紧密相关[1,2]。乙肝病毒X蛋白结合蛋白(HBXIP)作为HBX蛋白的作用因子，通过与HBX和survivn形成复合物调节细胞凋亡，并在多种恶性肿瘤中表达显著增强，与肿瘤的发生发展和患者预后密切相关[3]。Caspase 9作为一种凋亡促进蛋白，位于Caspase级联反应的上游，是线粒体凋亡通路的关键因子。本研究观察了HBXIP与Caspase 9在肝癌组织中的表达，现分析结果并探讨二者在肝癌发生、发展过程中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2014年12月～2017年4月西南医科大学附属医院收治的、行手术治疗的肝癌患者54例，男45例、女 9例，年龄36～73(48.67±9.32)岁；HBsAg阳性 49例，血清AFP≥400 μg/L 24例、<400 μg/L 30 例，伴肝硬化27例。肝功能Child-Pugh分级为A级47例、B级7例。术前均未接受放化疗等辅助治疗。术后病理证实为肝细胞癌，单个病灶43例、多个病灶11例，肿瘤直径≤5 cm 21例、>5 cm 33例，包膜完整34例、无包膜或包膜不完整 20例，转移14例，癌栓形成 19例，按照2010年国际抗癌联盟/美国癌症联合委员会(UICC/AJCC)第七次修订的TNM临床分期标准：Ⅰ～Ⅱ期34例，Ⅲ～Ⅳ期20例；高、中分化37例，低分化17 例。术中留取肝癌组织54例份(肝癌组)及手术切缘无肿瘤细胞浸润的癌旁正常组织29例份(癌旁组)。另选取同期因肝脏良性疾病行手术切除的正常肝组织15例份(对照组)，患者男5例、女10例，年龄36～80(62.07±12.18)岁，肝囊肿14例、肝血管瘤1例。

1.2 肝组织HBXIP、Caspase 9蛋白表达检测 采用免疫组化Envision法。取三组标本，经中性甲醛固定，常规石蜡包埋，连续4 μm厚切片，采用EDTA修复液高温高压修复抗原，具体步骤按照试剂盒说明书进行。以预实验中HBXIP和Caspase 9阳性的肝癌切片作为阳性对照，以PBS液代替一抗作为阴性对照。HBXIP兔抗人单克隆抗体购自美国Cst公司，Caspase 9兔抗人单克隆抗体购自英国Abcan公司，EDTA修复液购自福州迈新生物技术开发有限公司。HBXIP和Caspase 9阳性染色主要定位于细胞质，以细胞呈黄色或棕黄色为阳性。由两位病理医师进行双盲阅片，根据染色强度与阳性细胞数进行半定量分析。染色强度：细胞无显色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞数：≤5%为0分，>5%～25%为1分，>25%～50%为2分，>50%～75%为3分，>75%为4分。将染色强度与阳性细胞数的评分相加，总评分<2分为阴性、≥2分为阳性[4,5]。分析肝癌组织HBXIP与Caspase 9表达与患者临床病理参数的关系及二者的相关性。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验，相关性检验采用Spearman等级相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组HBXIP、Caspase 9表达比较 HBXIP阳性表达率：肝癌组、癌旁组与对照组分别为72.2%(39/54)、48.3%(14/29)、33.3%(5/10)；肝癌组明显高于癌旁组及对照组(P均<0.05)。Caspase 9阳性表达率：肝癌组、癌旁组织与对照组分别为38.9%(21/54)、62.1%(18/29)、80.0%(12/15)；肝癌组明显高于癌旁组及对照组(P均<0.05)。

2.2 肝癌组织HBXIP、Caspase 9表达与患者临床病理特征的关系 肝癌组织HBXIP表达与组织分化程度、癌栓形成、TNM分期有关(P均<0.05)，Caspase 9表达与肿瘤转移和组织分化程度有关(P均<0.05)。见表1。

2.3 肝癌组织HBXIP与Caspase 9表达的关系 肝癌组织中HBXIP表达阳性39例，其中Caspase 9表达阳性11例；HBXIP表达阴性15例，其中Caspase 9表达表达阴性5例。Spearman等级相关性检验显示，肝癌组织HBXIP与Caspase 9表达呈负相关(r=- 0.353，P=0.009)。

3 讨论

HBXIP是从肝癌HepG2细胞中克隆得到的一种细胞组成蛋白，可与HBX蛋白羧基末端结合，负性调节HBX蛋白活性，从而改变HBV的复制周期[6]。HBXIP在哺乳动物的许多组织中广泛表达，尤其是在肌肉组织中显著高表达。HBXIP为一种多功能的调节蛋白，是多种转录因子的辅激活因子。其通过多种分子机制参与调控细胞的生物学行为：① 与HBX和survivin形成复合物抑制Caspase 9激活，阻断Caspase 9介导的细胞凋亡线粒体通路[3]。② 上调细胞中单纯LIM结构域蛋白4、分泌粒蛋白Ⅲ、Lin-28B、YES相关蛋白、钙结合蛋白S100A4等表达，促进细胞增殖[7～10]。③ 与HBX共同定位于中心体的微管上，调节中心体的复制和细胞分裂[11]。④ 抑制细胞色素C氧化酶和丙酮酸脱氢酶α1表达，进而抑制细胞的糖异生作用[12]；也可通过激活LXRs/SREBP-1c/FAS信号级联，增加细胞内脂肪酸的合成[13]。近年来研究显示，HBXIP在乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、宫颈癌等多种恶性肿瘤中显著高表达，与肿瘤的生长、浸润转移、血管生成和患者预后密切相关[14，15]。在肝癌方面，孙纪三等[16]研究发现，在42例肝癌组织中HBXIP的阳性表达率为80.95%，明显高于正常肝组织。本研究结果与既往文献报道基本一致，在肝癌组织中HBXIP阳性表达率明显高于癌旁组织和正常肝组织，提示HBXIP表达异常可能在肝癌的演变过程中发挥重要作用，其可能成为肝癌临床诊断的标志物。本研究中，HBXIP在低分化肝癌中的阳性表达率明显高于高、中分化组织；TNM分期Ⅲ～Ⅳ期肝癌组织的阳性表达率明显高于Ⅰ～Ⅱ期组织；伴有癌栓形成者的阳性表达率明显高于无癌栓形成者。提示HBXIP表达增强与肿瘤的临床进展和恶性生物学行为相关，其表达变化可在一定程度上反映肿瘤的恶性程度。推测HBXIP表达升高可能调节某些基因的表达或修饰，从而抑制肝癌细胞凋亡，并促进其异常增殖、浸润转移和恶性分化。

注：肝癌组织HBXIP表达与组织分化程度、癌栓形成、TNM分期有关(P均<0.05)，Caspase 9表达与肿瘤转移和组织分化程度有关(P均<0.05)。

Caspase 9是一种能够特异性识别底物中天冬氨酸位点的半胱氨酸蛋白酶，属于Caspase家族启动组成员。在细胞内Caspase 9通常以没有活性的酶原形式存在，当线粒体受到凋亡信号刺激后，细胞色素C被释放到细胞质中，并在ATP的参与下与Apaf1和pro-Caspase 9形成复合物，激活Caspase 9，活化的Caspase 9继续激活下游的凋亡效应因子Caspase 3、Caspase 7，从而介导细胞凋亡的发生。本研究结果显示，肝癌组织Caspase 9阳性表达率低于癌旁组织和正常肝组织，提示在肝癌的发生发展过程中Caspase 9的表达受到抑制，致使细胞凋亡受到抑制，凋亡与增殖之间的平衡被打破，从而增加了肝细胞恶性改变的机会，导致肝癌的形成。进一步的研究发现，Caspase 9在低分化肝癌组织中阳性表达率明显低于高、中分化组织，提示正常肝细胞在向癌细胞转化的过程中可能存在Caspase 9基因表达的筛选，Caspase 9表达阳性的肝细胞容易发生凋亡而失去表达，Caspase 9表达阴性的肝细胞发生凋亡的能力较弱而得以生存下来，发展成为癌细胞。同时本研究还发现，发生肿瘤转移者Caspase 9阳性表达率明显低于无肿瘤转移者，表明Caspase 9表达下调与肝癌细胞的恶性分化和浸润转移相关，其可能作为评估肝癌恶性生物学行为的分子标志物。

研究发现，在肝癌HepG2细胞中，HBXIP能够与HBX和survivin形成复合物，进而抑制Caspase 9激活[3]。但目前尚未见到关于HBXIP和Caspase 9在肝癌组织中相互作用关系的报道。本研究结果显示，HBXIP和Caspase 9在肝癌组织中的表达呈负相关，表明HBXIP和Caspase 9在肝癌的发生发展过程中起拮抗作用，进一步证实了在肝癌组织中HBXIP高表达可能对Caspase 9激活具有抑制作用，通过降低细胞中Caspase 9表达，可抑制细胞凋亡，促进细胞异常增殖、恶性分化和浸润转移。

综上所述，肝癌组织中HBXIP表达增加、Caspase 9表达降低，二者的表达变化可促进肝癌的发生、发展。

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