张楚晗，宋佳诚，冯书风，田 青

（河北农业大学动物医学院 071001）

1 大肠杆菌的危害

大肠杆菌能引起动物的腹泻，主要表现仔猪黄痢、白痢、肠毒血症、肠炎和猪水肿病等多种临床症状[3]。还易引发不同品种、日龄鸡的急性败血症、肝周炎等多种症状，难于治愈、极易复发，给畜牧业带来严重损失，所以快速鉴别大肠杆菌在日常生产中具有重要的意义。

2 革兰氏染色法

革兰氏染色(Gramstain)是细菌学中最基本，最重要的鉴别染色技术，微生物学家Gram氏于1884年发明了著名革兰氏染色法后，100多年来一直使用着Gram氏发明的四步法，是各细菌实验室经常使用而不可缺少的细菌检验技术之一[1]。检验原理是通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁厚、肽聚糖网层次多且交联致密、不含类脂，故遇乙醇脱色处理时网孔缩小，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色[2]。而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、肽聚糖层较薄且交联度差、外膜层类脂含量高，乙醇处理时以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。

3 材料与方法

3.1 染色剂

革兰氏染色液（购自潍坊汉唐生物工程有限公司）。

3.2 菌种

培养16h的大肠杆菌。

3.3 革兰氏染色四步法

做一薄涂片，干燥后火焰固定。加上革兰结晶紫染液，作用90s，倒掉染色液后并使用蒸馏水冲洗后干燥。再加上革兰碘液，作用90s后蒸馏水冲洗，并倒掉多余的水后干燥。之后使用革兰酒精脱色液脱色，通常30s（视涂片的厚薄而定）后，蒸馏水冲洗后干燥，需注意勿过度脱色，将会导致错误的结果[5]。然后以革兰沙黄复染液复染30s，再以蒸馏水冲洗，干燥后置油镜下观察。经此方法染色，保留革兰结晶紫染液的细菌为革兰氏阳性菌，初染液被洗脱而使细菌染上沙黄等复染液的颜色为革兰氏阴性菌。

3.4 革兰氏染色三步法

做一薄涂片，干燥后火焰固定。加上革兰结晶紫染液，作用90s，倒掉染色液后并使用蒸馏水冲洗后干燥。再加上革兰碘液，作用90s后蒸馏水冲洗，并倒掉多余的水后干燥。之后把革兰氏染色中的第三步脱色和第四步复染合并一步 ，把两步的试剂按照1：1的比例混合均匀，作用30s后蒸馏水冲洗并干燥。这样就可以达到脱色和复染的双重目的，效果良好[4]。

4 结果与分析

表1 大肠杆菌的革兰氏染色四步法与三步法的结果

由表1可以看出，采用四步法的有122次合格，成功率为85.0%，三步法的有137次合格，成功率为97.9%，可得三步法成功率比四步法成功率高12.9%，制片时间比四步法平均快3min。染色结果的可靠性一方面因革兰氏染色的四步法关键在于严格掌握酒精脱色程度，另一方面取决于被检细菌的状态，新培养的细菌能保持它本身应有的染色性。用传统的革兰氏染色四步法，虽然容易接受但第三步乙醇脱色时间不好掌握，而且所需染色时间较长[6]。革兰氏染色三步法不但染色结果稳定，而且减少了操作步骤，缩短了实验时间，提高了成功率。通过改良的革兰氏三步法以期为兽医工作者提供参考，合理安排时间，提高效率。建议在实际操作中，工作人员应探索总结影响试验结果的各种因素，以保障试验结果准确性。