苏 黎 李 倩

（1 北京大学医药卫生分析中心，北京100191；2北京大学神经科学研究所，北京100191）

CCK-8被认为是作用最强的抗阿片肽。最先是Faris等人报道，腹腔内注射CCK-8显著降低其后给予吗啡的镇痛效应[1]。本实验室的在体实验也发现，大鼠脑室或脊髓鞘内注射CCK-8，能翻转吗啡镇痛，并呈现良好的量效曲线[2]，为内源性CCK-8在生理浓度下的抗阿片镇痛提供了有力的证据。中脑导水管周围灰质[3,4]、杏仁体、伏隔核[5]等脑区是CCK-8拮抗阿片作用的主要部位。伏隔核内纳络酮拮抗µ受体激动剂镇痛的有效剂量是CCK-8有效剂量的800倍，更说明CCK-8确实是一种生理情况下的抗阿片肽。进一步研究发现，在脑内CCK-8通过激活CCKB型受体拮抗µ受体介导的镇痛效应。运用单细胞膜片钳技术的实验发现，背根神经节同一神经元上CCK-8与µ阿片受体存在相互作用[6]。CCKB受体基因敲除小鼠与野生型小鼠相比，前者内源性和外源性阿片类物质的镇痛作用明显升高。因此，CCK-8拮抗µ受体的作用已勿庸质疑[7]。但CCKB受体调控µ受体功能的具体机制却始终没有确切证据。

最新的研究结果显示：CCKB受体可以和µ受体形成异源聚合体。这种异源聚合体的形成可明显减弱µ受体的功能[8]，是CCK-8拮抗吗啡镇痛的机制之一。那么，作为异源聚合体中的另一个组成成分，CCKB受体，其功能是否也会受到异源聚合的影响？本研究通过细胞荧光标记、胞浆钙离子浓度检测、ERK活化实验及细胞增殖能力检测等发现，相对于单转CCKB受体的细胞，稳定双转CCKBR和MOR的细胞中，CCKBR激动剂引起的胞浆钙离子释放增加，ERK活化比例增加，细胞增殖速度也有所加快，即CCKBR与MOR的异源聚合增强了CCKBR的功能。

方 法

1.稳定表达HA-MOR和FLAG-CCKBR的HEK293T细胞系的建立

运用重组质粒pcDNA3-HA-MOR和pcDNA4-FLAG-CCKBR转染HEK293T细胞，构建FLAG-CCKBR单 转、FLAG-CCKBR和HA-MOR双转的稳定表达细胞系[8,9], 其中前者具有新霉素抗性，后者具有博来霉素抗性，通过抗生素的筛选得到稳定转染的细胞系。

2.免疫荧光

采用本实验室成熟的免疫荧光方法[9]。细胞接种在包被有多聚赖氨酸的小玻片上，常规DMEM培养基培养24 h后用于后续实验检测。生长有转染细胞的小玻片，用0.01 M PBS 清洗三遍，用冰浴的4%多聚甲醛固定(pH 7.4)，10%的羊血清封闭1 h，用抗-FLAG的抗体(1:200, Sigma) 或/和抗HA抗体(1:50, Roche) 4℃孵育过夜，再用连接有FITC的山羊抗兔IgG (1:2 000, Jackson, USA) 或/连接有TRITC的山羊抗大鼠IgG (1:100, Santa cruz)室温孵育1～2 h，最后用Hochest (10 µg/ml，鼎国公司)孵育。PBS洗两遍后激光共聚焦扫描显微镜拍照(TCS SP2, Leica, Germany)。

3. Western blot法检测 ERK1/2

稳定转染HA-MOR或FLAG-CCKBR的HEK293T细胞，用无血清DMEM饥饿10～12 h，再用CCK8 37℃刺激：ERK1/2活化的剂量依赖曲线检测时，每种剂量 CCK-8刺激5 min。运用本实验室已有的Western blot方法检测蛋白的含量[8,9]。简而言之，收集好的HEK293T细胞沉淀物冰水裂解30 min，4℃离心12 000 g得到总蛋白裂解液，取50 µg总蛋白与上样缓冲液混合(31 mM Tris-HCl,pH 6.8, 1% SDS, 5% 甘油和 2.5% β-巯基乙醇 )，10%的SDS-PAGE凝胶电泳分离，电转移到PVDF膜上后用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭1 h，运用抗磷酸化ERK1/2的多克隆抗体(1:2 000 dilution; Cell Signaling) 4℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记二抗(Santa Cruz)室温孵育2 h后，运用增强化学发光法显像(ECL Kit, Santa cruz)。洗脱掉磷酸化-ERK1/2抗体后，再用抗-总的ERK1/2 的多克隆抗体孵育PVDF膜(1:2 000 dilution; Cell Signaling)。利用磷酸化-ERK1/2与总ERK1/2的条带灰度比值与未处理细胞的相应比值做标化处理，以计算刺激细胞中ERK活化的程度。

4.胞浆钙离子浓度测定

将细胞接种在共焦小皿中，24 h后用Hank' s缓冲液洗两遍，5 µM Fluo-3/AM，37℃孵育30 min并清洗3遍后利用激光共聚焦显微镜进行钙信号成像检测（Ex = 488 nm，Em = 530 nm，3 s一帧，Leica SP2）。使用仪器自带软件进行数据处理。

5.细胞增殖检测

本实验采用CCK-8试剂盒进行细胞增殖检测(CCK-8, 碧云天生物技术公司)。稳定转染CCKBR或CCKBR和MOR的HEK293T细胞以20 000细胞/孔的密度接种于96孔板中，加入含10%的胎牛血清的完全培养基培养（37 ℃, 5% CO2），隔天换液。不同剂量的CCK-8持续刺激48 h后再进行吸光度值检测。检测时先用试剂盒自带的计数溶液孵育1 h，用酶标仪读取450 nm吸光度值，从而计算出相应的细胞数。

6.数据分析

所有数据统计均使用GraphPad Prism 6.0 软件非配对t检验后，P＜ 0.05 为差异有显著统计学意义，P＜ 0.01为差异有极显著统计学意义。

结 果

1. CCKB受体与MOR共分布于细胞膜表面。在我们利用HEK293T建立的稳定转染CCKB受体、或CCKB受体与MOR共转染的细胞系中，观察到了两种受体均能成簇状分布在细胞膜表面（见图1A, B），并且分布区域有着很好的重合。

2.共转染细胞中，CCKB受体功能增强。我们利用建立起的两种稳转细胞系进行了CCKB受体活化后介导的胞内信号通路的检测，确定CCKB受体的功能在两种细胞中是否有差异。

（1）双转细胞系中，CCKB受体介导的胞内钙离子释放增多。钙离子浓度检测实验发现，单转CCKB受体的细胞中，100 pM的CCK-8刺激时才能引起胞浆钙离子浓度的升高（见图2Ab）；而10 pM的CCK-8刺激就已经可以引起双转细胞胞浆钙离子浓度升高。以钙离子信号最高点的荧光值与基线值做比值，统计组间差异发现，每个剂量的CCK-8刺激引起的两种细胞中钙离子浓度的变化差异都极其显著（见图2B，P＜ 0.01）。

图1 CCKBR及MOR在单转及双转HEK293T细胞中的分布。绿色表示FLAG-CCKBR，红色表示HA-MOR，蓝色是细胞核。图C用WB检测到FLAG-CCKBR在两种细胞系中表达。图A, B中的标尺分别为25 µm和50 µmFig. 1 Co-localization of CCKBR and MOR in stably transfected 293T cells. Green for FLAG-CCKBR, red for HA-MOR, and blue for nucleus. Fig. C showed detection of the CCBR expression in different cell lines by WB assays. Scale bar = 25 µm or 50 µm for Fig. A, B, respectively.

图2 CCK-8刺激引起单转或双转细胞中钙离子浓度升高。与单转组相比，双转细胞中CCKB受体被10-11、10-10及10-9 mol/L的CCK-8刺激后引起的胞内钙浓度的变化均增强，差异极其显著(P ＜ 0.01)Fig.2 CCK-8-induced increase of intracellular calcium concentration in single or co-transfected cells. The ef fi cacy was enhanced in co-expressing CCKBR and MOR HEK 293T cells, compared with that in single transfected CCKBR cells. From the stimulation of physiological to pathological concentrations of CCK-8, the increase of intracellular calcium concentration was larger in co-transfected cells (A), and the highest calcium concentration was higher too (B) (P ＜ 0.01).

图3 CCK-8刺激后稳转细胞中ERK活化。与单转组相比，双转细胞中CCKB受体被10-13、10-12及10-11 mol/L的CCK-8刺激后引起的ERK1/2磷酸化的比例显著增加(P ＜ 0.05)Fig.3 The efficacy of CCK-8 to stimulate ERK1/2 phosphorylation was enhanced in HEK 293T cells co-expressing FLAG-CCKBR and HA-MOR. HEK 293T cells co-expressing FLAG-CCKBR and HA-MOR or expressing FLAG-CCKBR alone were exposed to different concentrations of CCK-8 for 5 min, and ERK1/2 phosphorylation was determined. A.Representative immunoblots for phospho-ERK1/2 (upper panel) and total ERK1/2 (lower panel), respectively. B. Band densities were quanti fi ed by densitometric analysis. Data were normalized to total ERK1/2 and expressed as the fold of ERK1/2 phosphorylation over basal in CCK-8-untreated cells. *P ＜ 0.05, compared with cells that expressing FLAG-CCKBR, n = 3.

（2）双转细胞中，CCKB受体引起的ERK活化能力增强。我们的ERK活化实验再次证实：双转细胞中CCKB受体的功能明显高于单转细胞。

3. CCK-8刺激下，共转染细胞增殖能力更强利用CCK-8检测试剂盒检测细胞增殖能力发现，相对于单转细胞，双转细胞在CCK-8刺激后细胞增殖明显加快，尤其是10-10mol/L时，两种细胞增殖速度差异极其显著(P＜ 0.01)。

讨 论

GPCRs异源聚合现象近年频有报道，这种异源聚合体对G蛋白偶联受体的功能起着很重要的调节功能[10]。CCK和内源性阿片肽是神经系统中两大重要的神经肽，我们实验室早在20世纪80年代就已用大量在体及离体实验证实二者有相互调节，这种调节主要是借助二者的主要受体类型CCKB型受体和µ型阿片受体的相互作用实现的。但是两个体系间的相互作用到底是受体蛋白间的直接对话还是通过钙离子通道、cAMP或胞内钙离子等第二信使的调节实现的间接调控，这一问题却迟迟没有定论。随着技术的发展，我们坚持多年的研究终于有了突破。借助荧光寿命衰减检测方法，利用体外构建的过表达CCKB受体及µ型阿片受体的细胞体系，通过检测能量共振转移效率(FLIM-FRET)，首次证实了两种受体的确存在异源聚合体[8]。我们的结果表明CCKB受体与µ型阿片受体的异源聚合可以抑制阿片受体的功能，这种抑制有可能是通过改变阿片受体的结构所导致的。那么，作为相互聚合的共同体的另一方，CCKB受体的功能是否也会受到异源聚合的影响哪？本文正是基于这个假设设计了一系列实验。我们的初步实验结果发现：异源聚合体的存在对CCKB受体起到了正向调控的作用。

CCK是一种胃肠及神经肽，在消化及神经系统都有着重要作用。CCKB受体是CCK在神经细胞上表达的主要受体类型，在机体的多个生命活动中具有重要功能，当它异常表达时往往与疾病密切相关[12,13]，比如神经系统的焦虑、神经病理痛、吗啡耐受等；在消化系统CCKB受体的过表达常和癌症的发生等相关，是胰腺癌[14]、胃癌[15]等监控的重点指标。在以往CCKB受体异源聚合相关的研究中发现，当CCKB受体发生异源聚合时，其功能总会有所增强[16,17]，直接表现为活化后所介导的胞内钙离子浓度调控能力增强，进而调控细胞的增殖能力。

CCKB受体与CCK-8的结合能力通常较弱，CCKB受体活化后会引起胞内钙离子浓度升高，MAPK通路的活化[11,12]，这些通路活化的长时程效应之一就是对细胞增殖能力的调控。我们的实验发现：在单转CCKB受体的细胞中，当CCK-8浓度达到100 pM时，才会有比较明显的胞内钙离子浓度的升高。但在CCKB受体与MOR双转的细胞中，10 pM的CCK-8已可引起内钙离子浓度增高。比较二者钙离子浓度增高的程度，不难发现，在双转细胞中，CCKB受体引起的胞浆钙离子浓度变化显著高于单转细胞（见图2）。ERK激酶活化程度及细胞增殖实验都得到了相似的结果，即双转细胞中CCKB受体的功能增强了。结合之前的FLIM-FRET结果[8]，显然CCKB受体功能的增强是由于MOR与CCKBR形成异聚体调节的结果。

这些实验结果的发现有可能对CCK通过B受体调节阿片肽系统功能提出新的解释，也为癌症痛及吗啡耐受的治疗提供新的思路。实际上，联合用药或复合型药物的研发一直是近些年药物研发的重点[18]，比如将抑制CCKB受体的药物与阿片类药物联合使用或设计成多靶点药物有望能增强阿片镇痛效果。我们的结果为这些药物的研发提供了分子依据，更有利于新型药物的研制。

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