冯五文，王晶，张世洋，唐飞，盛永成，敖慧，彭成

注射用双黄连（冻干）（以下称双黄连冻干粉）是由金银花、连翘、黄芩制成的临床常用的广谱抗病毒中药注射剂，然而，近年来屡屡发生的不良反应给双黄连冻干粉的使用蒙上了阴影。作为一种使用广泛且不良反应高发的注射剂品种，双黄连冻干粉亟需建立有效的质量控制方法保障其质量。指纹图谱作为控制中药注射剂质量的重要手段，已被2015版《中国药典》用于双黄连冻干粉的质量控制，然而，该版药典仅对7个特征峰进行了控制，难以全面反应双黄连冻干粉的特征成分。因此，有必要对双黄连冻干粉建立更有效的指纹图谱质量控制方法。在收集与制备不同双黄连冻干粉样品的基础上，建立双黄连冻干粉的UPLC指纹图谱，并结合相似度分析和聚类分析进行样品的质量分析与评价，为双黄连冻干粉质量控制的提高提供依据。

1 仪器与试药

仪器：超高效液相色谱仪（Waters Acquity Ultra Performance LC，美国）；Masslynx 4.1 色谱工作站；ACQUITY UPLC® HSS T3 色谱柱（2.1mm ×100 mm；1.8 μm）；Milli-Q超纯水机（Millipore，美国）；KQ-5000DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；十万分之一电子分析天平（AB135-S，Mettler Toledo，瑞士）。

试剂：乙腈为色谱纯（Fisher，美国），磷酸为分析纯（北京化工厂），水为哇哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

对照品：绿原酸（MUST-12031402）、隐绿原酸（MUST-11112203）、新绿原酸（MUST-11112203）、异绿原酸A（MUST-11061601）、咖啡酸（MUST-12042405）、异绿原酸B（MUST-11083102）、异绿原酸C（MUST-11081803）、连翘酯苷A（MUST-11052001）、黄芩苷（MUST-11101403）、1,3-二咖啡酰奎尼酸（MUST-11060601），黄芩素（MUST-10031701）。以上对照品均购自成都曼斯特生物科技有限公司，纯度均大于98%。

样品来源：正常双黄连样品（NS1-NS5）、过期双黄连样品（GQ1-GQ5）及临床导致过不良反应的双黄连样品（AR1-AR5）由哈药集团中药二厂生产。为模拟双黄连冻干粉运输储藏过程可能出现的情况，同时制备了双黄连冻干粉处理样品。高温处理样品（TS1-TS5）的制备：取正常样品于60℃恒温箱中放置10天即得；光照处理样品（LS1-LS5）的制备：取正常样品于光照强度4500 ± 500Lx的可调光源下持续照射10天制得；暴露处理样品（ES1-ES5）的制备：取正常样品，开启瓶口后放置于室温避光环境10 天制得。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

流动相乙腈（A），0.2%甲酸-水（B）；流速0.2 mL∙min-1梯度洗脱；柱温室温；检测波长350nm；进样量为5 µL。梯度洗脱程序：0～5 min，8%～10% A；5～10 min，10%～12% A；10～11 min，12%～18% A；11～18 min，18%～25% A；18～24 min，25%～30% A；24～28 min，30%～50% A；28～29 min，50%～100% A。

2.2 对照品及供试品溶液制备

2.2.1 对照品溶液制备 分别精密称取黄芩素、黄芩苷、绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、咖啡酸、连翘酯苷A、异绿原酸C、异绿原酸B、异绿原酸A、1,3-二咖啡酰奎尼酸对照品适量，置棕色容量瓶中，甲醇溶解，0.22 µm 微孔滤膜过滤，置4°C冰箱保存备用。

2.2.2 供试品溶液制备 精密称取双黄连冻干粉粉末适量，置棕色容量瓶中，加水使溶解，制成每1 mL含30 mg固体的溶液，用0.22 µm 微孔滤膜过滤即得，置4 °C冰箱保存备用。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取同一供试品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样6次，分别计算各共有峰的保留时间与峰面积RSD值，结果表明，各共有峰保留时间的RSD均小于5%，峰面积的RSD均小于5%，说明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于制备后0、1、2、4、6、8 h进样，按2.1项进行色谱条件测定，结果表明，各共有峰的保留时间和峰面积RSD均小于5%，说明供试品溶液在8小时内基本稳定。

2.3.3 重复性试验 取同一批次样品，平行制备供试品溶液6份，按2.1项下色谱条件测定指纹图谱，结果表明，各共有峰的保留时间和峰面积的RSD均小于5%，说明重复性良好。

2.4 样品测定

取25批正常注射用双黄连（冻干）样品，按“2.1”项下色谱条件进行分析，记录色谱图，混合对照品溶液和典型注射用双黄连（冻干）溶液色谱图见图1，所有批次样品色谱图见图2。通过选择5批正常注射用双黄连（冻干）样品，确定了26个共有峰在正常样品中均有出现。通过对照品指认，确定了其中11个共有峰：新绿原酸（1号峰）、绿原酸（5号峰）、隐绿原酸（6号峰）、咖啡酸（7号峰）、1,3-二咖啡酰奎尼酸及（10号峰）、连翘酯苷A（14号峰）、:异绿原酸B（17号峰）、异绿原酸A（18号峰）、异绿原酸C（19号峰）、黄芩苷（20号峰）、黄芩素（25号峰）。

图1 注射用双黄连（冻干）混合标准品与正常样品色图谱

图2 不同批次注射用双黄连（冻干）化学指纹图谱

2.5 参照峰的选择

在各批次注射用双黄连（冻干）样品中，20号峰（黄芩苷）保留时间适中，相对峰面积最大，且分离度好，故选择20号峰为参照峰。在此基础上，计算各批次样品中共有峰的相对保留时间和相对峰面积。

2.6 数据分析

2.6.1 指纹图谱相似度评价 将测定获得的30批双黄连冻干粉指纹图谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004A 版）进行分析，采用5批正常样品图谱生成标准对照特征图谱R。30批样品与标准对照特征图谱R的相似度匹配结果见表1。

表1 双黄连（冻干）正常样品与标准对照图谱R相似度

2.6.2 层次聚类分析 以共有峰的相对峰面积为聚类变量，采用IBM SPSS Statistics 20.0软件，对双黄连正常样品与特殊处理样品进行聚类分析。聚类方法采用组间联接法，以Euclidean距离为度量标准，以全距从0到1的标准化法进行聚类，聚类结果见图3。

4 讨论

中药指纹图谱评价方法将中药视为内部成分相互联系的整体，是从整体的角度出发控制中药质量的方法，具有能反应中药多组分、多靶点作用的特点[1,2]。因此，指纹图谱评价法已被WHO等机构采纳用于草药及制品的质量控制。《中国药典》2010版对双黄连冻干粉的化学成分控制包含了指纹图谱检查与成分含量控制，分别采用不同的色谱条件对指纹图谱和3个指标成分进行检测，步骤操作繁琐；目前文献报道的双黄连冻干粉指纹图谱研究主要是采用HPLC法，运行时间一般在100 min左右，具有检测时间长、特征参比峰少等特点[3-6]，不利于样品的检测。UPLC是一种近年来较为常用的色谱分离技术，相对于传统的HPLC 技术，具有更号的分离度、灵敏度以及分离速度[7,8]。应用UPLC技术，本文建立了双黄连冻干粉的质量控制方法，相对于目前文献报道的方法，本文建立的方法具有检测时间更短，特征峰信息更多的特点，能为提高双黄连冻干粉质控水平提供参考。

图3 不同注射用双黄连（冻干）聚类分析结果

为全面地反映所建立方法的有效性，收集了不同类型的双黄连冻干粉，包括正常样品、临床上导致过不良反应的样品以及过期样品，并结合实际储藏、运输过程中可能遇到的情况，制备了高温处理样品、暴露处理样品、光照处理样品。指纹图谱显示，特殊样品的10号峰左右的色谱峰（图2虚线标记）与正常样品有较大差异，提示1,3-二咖啡酰奎尼酸等成分化学性质不稳定，易受光照等影响，其含量差异可用于反应双黄连冻干粉的质量。相似度分析结果表明，正常样品色谱图与标准色谱图具有较高的相似度（≥0.999），而特殊样品与标准色谱图也具有较高的相似度（≥0.997），提示相似度分析不能很好地用于区分特殊样品。聚类分析结果显示，正常样品能聚为一类，表明所建立的方法能较好地区分正常样品与特殊样品；同时，不良反应样品通过聚类分析被聚到不同特殊样品组中，提示临床上引发不良反应的原因与多种因素有关。综合聚类分析结果，所建立的方法能较好地区分正常样品与特殊样品，为双黄连冻干粉质量控制方法的提高提供了依据。