陆彭磊 蔡少平

（上海中医药大学附属上海市中西医结合医院，上海 200082）

铜绿假单胞菌是引起相关性肺炎的常见致病菌之一，不仅可以对烧伤患者、老年患者、获得性免疫缺陷症患者等造成致死性感染外，也是院内获得性感染的最主要病原菌之一。同时在院内，铜绿假单胞菌可引起呼吸机相关性肺炎、手术切口感染、植入物感染等疾病［1］。在新形势下，随着全球耐药菌的增多、抗生素的不规范使用、免疫缺陷患者引发多重耐药感染率的上升，铜绿假单胞菌的抗生素选择和应用一直是临床科室亟待解决的问题［2］。除了接受广谱抗生素的治疗外，实践证明中药注射液与抗生素配伍后溶液剂量稳定有效［3］。痰热清注射液是由黄苓、熊胆粉、山羊角、金银花和连翘等提取而成，具有抗菌、抗炎、抗病毒、化痰、止咳作用的中成药注射液［4］。喜炎平注射液主要成分包括穿心莲内酯磺化物，临床上具有较强的广谱抑菌活性和抗病毒作用［5］。痰热清注射液、喜炎平注射液与头孢他啶注射液联合作用的抗菌效果临床评价依据较少，导致临床选择困难。因此本研究对痰热清注射液、喜炎平注射液与头孢他啶注射液联合作用时在体外实验中是否能起到联合抑菌的效果进行探究，以期为中药抗感染治疗提供应用基础。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 研究资料 1）菌株选择：选择ATCC27853铜绿假单胞菌标准菌株（购自上海市临检中心）。2）细菌悬液的制备：采用细菌生长法［6］制备菌液。铜绿假单胞菌从-80℃超低温冰箱取出，无菌操作取状态良好的菌落或菌苔，接种于2～3 mL普通肉汤管放入35℃（10%CO2）恒温培养箱中24 h进行复苏，复苏后转种至羊血琼脂培养基，置于孵育环境中（10%CO2）35℃培养48 h。然后用无菌生理盐水制备成0.5麦氏单位的菌悬液备用。

1.2 仪器与试剂 循环型超净工作台（赛默飞世尔仪器有限公司），生物安全柜（赛默飞世尔仪器有限公司），电热恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司），二氧化碳培养箱（上海精宏实验设备有限公司），-20℃冰箱（中科美菱低温科技有限责任公司），-80℃超低温冰箱（青岛海尔特种电器有限公司），4℃冰箱（青岛海尔特种电器有限公司），高温高压蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂），台式高速离心机（上海力申科学仪器有限公司），显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司）。痰热清注射液（上海凯宝药业股份有限公司，批号：20160918，规格：10 mL/支）在本次实验中使用原倍原液。喜炎平注射液（江西青峰药业有限公司，批号：2016120103，规格：每支2 mL∶50 mg）在实验中加入无菌注射用水8 mL复溶，并且配置成5 μg/mL喜炎平原液。注射用头孢他啶（海南海灵化学制药有限公司，批号：1609216，规格：1 g/支）在实验中加入无菌注射用水200 mL并且稀释成4 μg/mL头孢他啶原液。

1.3 干预方法 1）单独药敏试验：采用倍比稀释法［7］制备痰热清原液，喜炎平原液与头孢他啶原液的浓度梯度稀释液。取无菌96孔微量板，按从左至右编号为1～12号孔，先在2～10孔中预先加入50 μL无菌注射用水。1号孔加入100 μL痰热清原液（1号孔痰热清稀释倍数为1∶1），从1号孔中混匀吸出50 μL痰热清原液加入2号孔中（2号孔痰热清稀释倍数为1∶2），以此类推，倍比稀释法至第10号孔（10号孔痰热清稀释倍数为 1∶512）。 1～10 号每孔加入 50 μL 细菌悬液混匀。设置11号孔为阴性对照，加入100 μL无菌注射用水；12号孔为阳性对照，加入100 μL细菌悬液。再分别如上制备喜炎平与头孢他啶的浓度梯度96孔微量板。各药物浓度重复3次，封板后置于湿盒内，放置于35℃ CO2培养箱中18～24 h后观察生长情况。2）联合药敏试验：倍比稀释法制备痰热清原液，喜炎平原液与头孢他啶原液的浓度梯度稀释液。在无菌96孔微量板上，进行从左至右编号为1～9号孔，从上至下编号为A～I号孔，从左至右、痰热清注射液从1∶16倍比稀释至1∶4096，每孔分别加25 μL稀释液。从上至下注射用头孢他啶从 1∶1 倍比稀释至 1∶256，每孔分别加 25 μL稀释液。然后在每孔加50 μL细菌悬液混匀，在96孔板底部空余孔内设置阴性对照，加入100 μL无菌注射用水，阳性对照，加入100 μL细菌悬液。再分别如上制备喜炎平与头孢他啶的浓度梯度96孔微量板，各药物浓度重复3次，封板后置于湿盒内，放置于35℃CO2培养箱中18～24 h后观察生长情况。3）判读标准与FIC指数计算：3次重复试验中，两次实验均无细菌生长澄清的孔为阴性，记录“-”。两次实验均有细菌生长的孔为阳性，记录“+”。采用视觉法判定终点。以80%抑制作为观察终点，以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。分级抑菌浓度指数（FIC）＝MIC甲药联合/MIC甲药单用+MIC乙药联合/MIC乙药单用。根据FIC指数判读标准，FIC指数≤0.5为协同作用；0.5＜FIC≤1 为相加作用；1＜FIC≤2 为无关作用；FIC＞2为拮抗作用［8］。

2 结 果

2.1 单独药敏试验MIC测定结果 见表1～表3。头孢他啶稀释度为1∶32时小孔内完全抑制细菌生长，即MIC值为0.125 μg/mL。痰热清注射液为1∶16时小孔内完全抑制细菌生长，即MIC值为1∶16。喜炎平注射液为1∶8时小孔内完全抑制细菌生长，即MIC值为0.625 μg/mL。

2.2 联合药敏试验测定结果 见表4～表5。头孢他啶稀释倍数中1∶256，痰热清注射液稀释倍数中1∶64为联合应用时FIC值。另外，头孢他啶稀释倍数中1∶256，喜炎平注射液稀释倍数中1∶16为联合应用时FIC值。根据FIC公式计算得头孢他啶联合痰热清注射液FIC指数为0.375为协同作用，头孢他啶联合喜炎平注射液FIC指数为0.625为相加作用。

3 讨 论

近年来，随着老龄化社会年老体弱、营养不良患者和免疫力低下、免疫缺陷患者的增多，临床上对于抗生素广泛使用而导致的细菌耐药性产生的问题日趋凸显和日益严重［9］，并且已经严重影响了临床对于感染性疾病的治疗效果和患者的整个康复过程［10］。而中药的抗感染和抑菌作用古已有之，并且中药在抗感染方面具有低耐药性、多作用靶位的广谱抗菌效果、药源广泛、价格低廉等优点［11］。因此在21世纪提倡减少不必要的抗生素使用的大背景下，对已知成分的中药注射液与抗菌药物联合应用也成为了一种对抗多重耐药的新型手段，对于今后的抗感染治疗和抗生素的合理选择意义重大。

表1 头孢他啶注射液单独对铜绿假单胞菌的MIC

表2 痰热清注射液单独对铜绿假单胞菌的MIC

表3 喜炎平注射液单独对铜绿假单胞菌的MIC

表4 头孢他啶联合痰热清注射液对铜绿假单胞菌的MIC

表5 头孢他啶联合喜炎平注射液对铜绿假单胞菌的MIC

本实验通过对痰热清注射液、喜炎平注射液与头孢他啶注射液联合体外抑制铜绿假单胞菌生长。体外实验中均对铜绿假单胞菌出现了抑菌效果，其中联合应用时抑菌效果均高于单药单独应用时的抑菌效果，结果同时显示痰热清注射液联合时的抑菌效果优于喜炎平注射液联合时的抑菌效果，与李亚娜和闫春生等研究一致［12-13］。

本研究结果表明，中药注射液在联合应用对抗铜绿假单胞菌上效果均优于单独应用对抗铜绿假单胞菌。出现这一现象的可能原因为破坏细菌的新陈代谢、改变细菌细胞的通透性、小分子细胞膜灭活细菌、氧化细菌体内的活性基团等的中药抑菌机制和头孢他啶注射液影响细菌细胞壁的合成作用联合，可以加速细菌溶菌死亡，起到事半功倍的效果。

目前对铜绿假单胞菌引起的感染，临床上已经主张使用痰热清注射液和喜炎平注射液等来抗感染治疗。本研究证明痰热清注射液，喜炎平注射液与头孢他啶注射液联合均能起到联合抑菌作用，其中痰热清注射液相较于喜炎平注射液作用更好。但也需注意配伍禁忌，发现药物不良反应立即停药［14］。因此中药在应用过程要遵从辨病施治的特点，就需要加强合理用药，并且在应用过程中选择安全有效的制剂方法和合适的药物剂型［15］。但痰热清注射液和喜炎平注射液联合抗生素的作用机制和如何优化临床治疗方案尚需进一步证实。需要后期进一步对其作用机制深入研究并收集证据进行临床规范化研究。

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