脓毒症大鼠心肌损伤及清毒提取液修复作用的实验研究*

2018-03-14宋欠红朱虹江李云华罗庆文

中国中医急症 2018年2期

宋欠红樊睿朱虹江李云华罗庆文叶勇赵淳

（云南中医学院，云南昆明 650021）

脓毒症（Sepsis）是临床难治、多发病［1］。在 ICU 患者中发病率高，耗费大量医疗资源。尽管医疗技术日渐进步，但病死率仍较高达30%～70%［2］。脓毒症的大部分临床表现有发热，属中医学“外感热病”“温毒”等范畴［3］。脓毒症并发心脏损害是其致死的重要危险因素。中医药治疗脓毒症可通过多途径、多环节、多靶点发挥治疗作用［4-5］。清毒提取液是本文通信作者全国名中医赵淳教授治疗脓毒症气分热毒型的常用方剂，临床疗效显著。本实验通过观察清毒提取液对脓毒症大鼠血清肌钙蛋白Ⅰ（cTnⅠ）、B型尿钠肽（BNP）及心肌组织丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）水平的调节，探讨其对脓毒症大鼠心肌损伤的修复作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级健康雄性Wistar大鼠90只，体质量260～300 g，生产许可证号：SCXK （滇）2015-0003，合格证号：430067000007126，由昆明医科大学动物中心提供。大鼠自由饮水进食，实验前1周在实验环境中饲养，饲养温度（22±2）℃，湿度 40%～70%。

1.2 试药与仪器清毒提取液制备，具体组方为生大黄 15 g，炒黄连 15 g，炒黄芩 10 g，黄柏 10 g，栀子15 g［6-7］。以上 5 味，共 10 剂剂量。药物浸泡 30 min，水煎2次，首煎生大黄后下10 min。加6倍量水，每次煎20 min，2次药液混匀。减压浓缩经0.2 μm过滤器过滤并调整质量浓度至 1 g/mL（按生药计算）［8-9］。由云南中医学院临床医学院制剂室提供。注射用乌斯他汀购自广东天普生化医药股份有限公司。cTnⅠ试剂盒由拜耳公司提供；BNP试剂盒由罗氏公司提供；SOD试剂盒由Thermo Fisher公司提供；考马斯亮蓝由北京索莱宝科技有限公司提供；MDA试剂盒由上海信裕科技有限公司提供。FA/JA型电子天平由上海方瑞仪器有限公司生产；723 SPC型分光光度计由上海奥析科学仪器有限公司生产；PSD800型离心机由苏州星亿机械有限公司生产。

1.3 造模与分组 1）分组及给药：将大鼠用随机数字表法随机分为6组，分别为假手术组、模型组、乌斯他汀组各10只，清毒提取液低剂量组、清毒提取液中剂量组和清毒提取液高剂量组各20只。清毒提取液成人每日用量为65 g，实验大鼠与成人用药量按照成人与大鼠体质量比例计算，方法：成人用量（以体质量70 kg计）×0.0026×50=大鼠用量/kg 体质量［10］。清毒提取液低剂量组、中剂量组、高剂量组分别给予4.25 mL/kg、8.5 mL/kg、17 mL/kg。于盲肠结扎穿孔术前1 h和术后24 h、48 h、72 h、84 h 分别给大鼠清毒提取液灌胃、生理盐水灌胃、乌斯他汀静脉注射。假手术组和模型组予以生理盐水10 mL/kg灌胃。乌斯他汀组予以注射用乌斯他汀13000 U/kg尾静脉注射。注射用乌斯他汀10万单位加入0.9%氯化钠10 mL，使用针头，左侧尾静脉注射。2）动物模型制作：参照陆焱等［11］报道的方法基础上进行改良，复制腹腔感染型脓毒症大鼠模型。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠。在下腹部正中切长约2 cm切口，分离盲肠与大肠的系膜，将肠腔内粪便挤向远端，用灭菌3号丝线结扎盲肠，保持肠道通畅。在结扎范围内用12号针头穿刺两次肠壁，形成肠瘘，两个针孔相距约3 mm，为防止伤口愈合在第2针孔内放置一条宽2 mm的橡胶引流片。关闭腹腔，逐层缝合。为补充手术过程中体液的丢失术后立即皮下注射生理盐水，剂量1 mL/100 g体质量。假手术组只打开腹腔，不盲肠造瘘，然后逐层缝合腹壁。

1.4 标本采集于盲肠结扎穿孔术后96 h使用10%水合氯醛（2.4 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，待麻醉生效后，将大鼠仰卧位固定。于股动脉处取血约3 mL，待血液在试管中自然凝固后，予以离心，取上清液即血清分装于ependor管置于-20℃冰箱，进行检测血清cTnⅠ、BNP。股动脉取血后，迅速打开胸腔，取左心室室壁组织3 mm×3 mm，剪碎，研磨，离心取上清液，左心室匀浆上清液在冰浴下使用磷酸盐缓冲液制成10%组织匀浆液，离心取上清液以备检测心肌组织MDA含量及 SOD 活性［12］。

1.5 观察指标 1）大鼠血清cTnⅠ、BNP检测：ELISA试剂盒严格按照说明书操作，进行检测。2）MDA含量的测定：取制备的左心室匀浆上清液，按照试剂说明书依次加试剂，混匀，沸水浴，离心取上清液，于532 nm处测光密度［13］。采用硫代巴比妥酸法测定。3）SOD活性的测定：采用黄嘌呤氧化酶法测定。根据说明书操作后，读取440 nm下各组吸光度。以上检测均严格按照说明书操作，用考马斯亮蓝法测定组织的蛋白含量。

1.6 统计学处理应用SPSS21.0统计软件。计量资料以（±s）表示，采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清cTNⅠ、BNP水平比较见表1。清毒提取液低、中、高剂量组与模型组比较，使用清毒提取液治疗后cTnⅠ水平均有降低（均P＜0.05）；清毒提取液低、高剂量组与模型组比较，可降低BNP水平（均P＜0.05）；清毒提取液中、高剂量组与乌斯他汀组比较，cTnⅠ差异无统计学意义（均P＞0.05），清毒提取液低、高剂量组与乌斯他汀组比较，BNP差异无统计学意义（均P＞0.05）。

表 1 各组血清 cTnⅠ、BNP水平比较（ng/mL，±s）

与模型组比较，△P＜0.05。下同。

组别 n cTnⅠ BNP假手术组 10 0.13±0.02 1.02±0.21模型组 4 1.85±0.22 4.89±0.53乌斯他汀组 6 0.79±0.11 2.83±0.39清毒提取液低剂量组 11 1.28±0.19△ 3.11±0.43△清毒提取液中剂量组 15 0.91±0.17△ 4.33±0.51清毒提取液高剂量组 16 0.74±0.12△ 3.04±0.45△

2.2 各组心肌组织MDA、SOD水平比较见表2。清毒提取液中、高剂量组与模型组比较，MDA水平均有降低（P＜0.05）；清毒提取液高剂量组与模型组比较，可以提高SOD水平（P＜0.05）；清毒提取液中、高剂量组与乌斯他汀组比较，MDA差异无统计学意义（P＞0.05）；清毒提取液高剂量组与乌斯他汀组比较，MDA差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组心肌组织MDA、SOD水平比较（±s）

组别 n MDA（μmol/mg） SOD（U/mg）假手术组 10 0.43±0.08 14.02±1.21模型组 4 1.85±0.22 8.89±1.53乌斯他汀组 6 0.79±0.11 12.33±1.39清毒提取液低剂量组 11 1.48±0.31 9.11±1.43清毒提取液中剂量组 15 0.91±0.17△ 9.03±1.41清毒提取液高剂量组 16 0.74±0.21△ 12.04±1.88△

3 讨论

心肌损伤是脓毒症常见的脏器损害，常表现为心律失常、心肌供血不足和心力衰竭，一旦出现心力衰竭常导致其他器官功能的进一步恶化［14］。其主要病机为热毒炽盛，耗伤气阴，心气阴两虚。临床以发热、面赤、胸闷、心悸、乏力、气短、舌质红、苔黄腻，脉滑数为主要表现。其根本原因属热毒浸淫，气分热盛，故应用清热解毒，泻火攻下之法。临床研究发现应用清毒提取液能够缓解患者上述证候，并能降低患者心肌损伤、心力衰竭标志物如cTnⅠ、BNP的水平。

清毒提取液为黄连解毒汤加大黄而成，以大黄、黄连、黄芩、黄柏、栀子按 3∶3∶2∶2∶3 比例组方［15-16］。其不仅泻火解毒力强，且有引热下行之功，使热邪从大肠而解。该方是本文通信作者全国名中医赵淳教授治疗脓毒症气分热毒型的常用方剂，临床疗效显著，其组方原则主要是根据脓毒症主要病机即菌、毒、炎浸淫三焦，三焦热盛，热毒内侵，热扰心神，热毒耗伤心气、心阴所确定。

应用盲肠结扎穿孔复制的脓毒症模型，其脓毒症机制符合热毒蕴结阳明大肠，阳明热盛、阳明腑实的特点。因肠道有多种细菌，形成肠瘘后，细菌快速繁殖，并产生大量内毒素，故脓毒症发生急剧、严重，心肌损害产生比较典型。该方具有清热解毒、泻火攻下，荡涤湿热毒邪之功，属釜底抽薪之法。三黄清解三焦火毒，栀子引邪从小便而出，大黄泻火攻下，清解阳明热毒，荡涤湿热毒邪。现代药理研究发现，黄芩具有解热、抑菌、抗炎、抑制血小板聚集、抗氧化作用。黄连能够兴奋心脏、增强心肌收缩力、增加冠脉血流量、抗心律失常作用。黄柏具有抗炎、降压作用。栀子具有解热、抗炎、抗内毒素作用。大黄能增加肠蠕动、促进排便，抗动脉粥样硬化，改善血液循环，保护肠屏障功能调节免疫作用［17］。

本实验发现脓毒症状态下cTnⅠ、BNP增高，证明脓毒症状态下大鼠心肌存在不同程度地损伤。清毒提取液低、中、高剂量组与模型组比较，3组cTnⅠ水平均有降低；清毒提取液低、高剂量组与模型组比较，BNP水平均有降低。cTnⅠ、BNP 2项指标主要从心肌损伤及心力衰竭的程度方面反映脓毒症对心脏的损害［18］，清毒提取液降低cTnⅠ、BNP的水平，证明清毒提取液可有效降低脓毒症心脏损害。清毒提取液中、高剂量组与模型组比较，心肌MDA水平均降低；清毒提取液高剂量组与模型组比较，可提高心肌SOD水平，证明高剂量清毒提取液可提高SOD活力，降低 MDA含量。其作用机理可能是全方发挥解热、抑菌、抗内毒素、清除氧自由基协同作用，特别是黄连能够兴奋心脏、增强心肌收缩力、增加冠脉血流量；大黄能改善血液循环，保护肠屏障功能［19］。本实验初步显示，清毒提取液是治疗脓毒症心肌损伤的有效方法，其更深入的作用机理有待进一步研究。

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