刘秀峰，许静杨，袁文娅，梁 丹，时晓伟

(1.天津市农作物研究所，天津300381;2.天津市植物保护研究所，天津300381)

由条形柄锈菌小麦专化型(Puccinia striiformis f.sp.tritici，Pst)引起的小麦条锈病暴发性强、发生范围广，在我国曾发生多次大流行，危害严重［1］。利用分子手段研究小麦条锈菌的群体遗传结构、远距离传播等有助于了解其流行动态。简单重复序列(Simple sequence repeat，SSR)通常是由1～6 个核苷酸组成的串联重复单元，广泛分布在真核和原核生物基因组中，具有多态性高、重复性高、覆盖面广等优点。在小麦条锈菌研究中，SSR标记已应用于群体遗传多样性分析和分子标记开发等方面［2-5］。目前小麦条锈菌研究所用的SSR标记数量有限，主要来自于cDNA文库和表达序列标签(Expressed sequence tag，EST)文库［6-8］。最近报道了由小麦条锈菌基因组开发的SSR引物，即根据北美的PST130基因组序列开发的 25个 SSR引物［9］和中国的CY32基因组开发的20个多态性SSR引物［10］。由于小麦条锈菌表现出较低的遗传差异，应用SSR引物分析小麦条锈菌群体遗传结构时，往往获得的遗传差异信息过少［11］。可见，现有的小麦条锈菌SSR标记数量不能满足其分子生物学研究的需求。为了提高SSR分辨小麦条锈菌遗传差异的能力，有必要开发更多的SSR标记。RNA－seq是近年建立的基于深度测序的转录组分析新技术。本研究在通过RNA－seq技术对小麦条锈菌夏孢子形成时转录组测定基础上，分析其转录组序列，发掘SSR位点，旨在为小麦条锈菌群体遗传结构分析等开发新的SSR引物。

1 材料和方法

1.1 材料

小麦条锈菌为CY31、CY32、CY33小种和致病型V26单孢子堆分离物，用于繁殖的小麦品种为铭贤169。

1.2 方法

1.2.1 小麦条锈菌采集、RNA提取及测序 将小麦条锈菌分离物分别制成孢子悬浮液，用微型喷雾器分别喷雾接种于铭贤169第1片完全展开叶上。10℃下黑暗保湿 24 h后，放置于人工气候室内［17℃/14℃(日/夜)，每日光照16 h］。待叶片出现花斑后，剪去多余心叶，加上隔离罩。接种后16 d开始产生夏孢子时，立即分别收集夏孢子保存于液氮中。分别称取20 mg小麦条锈菌夏孢子，采用Trizol法(Invitrogen，USA)提取小麦条锈菌总RNA，形成该时刻转录组的RNA池。提取过程中所用器具和耗材均经过DEPC处理。采用琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，并用微量紫外分光光度计检测其纯度和浓度，然后利用Illumina HiSeqTM2000进行转录组测序，由诺禾致源公司执行。

1.2.2 小麦条锈菌转录组SSR分析 对转录组测序得到的原始reads进行质量控制，去除带接头的reads，去除片段内未知碱基比例大于10%的reads，去除质量值小于20的碱基数占整个reads 50%以上的低质量 reads。然后，用 TopHat2［12］将过滤后的reads比对到小麦条锈菌基因组上，其错配碱基数不高于2 bp。使用Trinity软件［13］将未比对到小麦条锈菌基因组的reads进行组装，参数为默认参数，最短contig长度设置为200 bp。比对和组装以后得到小麦条锈菌转录组的转录本，选取每个基因最长的转录本作为unigenes。将4个小麦条锈菌分离物转录组的unigenes合并，去除重复的unigenes，得到小麦条锈菌转录组高质量的unigenes。

利用 MISA 软件参照 http://pgrc.ipkgatersleben.de/misa/misa.html中步骤对小麦条锈菌unigenes进行SSR位点搜索，搜索的SSR基序重复单元长度为1～6个核苷酸，其限制条件为单核苷酸重复不低于10次，二核苷酸重复不低于6次，三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复不低于5次，2个SSR位点间的距离不大于100 bp则视为复合 SSR。用 Primer 3(http://primer3.sourcegorge.net)软件对搜索到的SSR位点设计引物。设计原则为引物序列中不含SSR、获得的引物序列可以比对到unigenes序列、去除可比对到不同unigenes序列的引物、引物的5'端允许有3个碱基的错配、退火温度在55～64℃、引物长度在18～27 bp、G+C含量在40%～60%。同时注意尽量避免出现发卡结构等二级结构。

随机合成100对符合筛选条件的引物，每对引物中一条引物的5'端连接FAM荧光素，内标为GS500LIZ。以小麦条锈菌 CY31、CY32、CY33基因组DNA为模板进行扩增，PCR产物经ABI 3730XL分析后进行引物筛选。

2 结果与分析

2.1 小麦条锈菌RNA－seq数据质量评估

小麦条锈菌CY31、CY32、CY33小种和致病型V26的 RNA 质量浓度范围在 165～206 ng/μL，18S、28S条带清晰(图1)。4个样品共产生396 711 824个原始reads，原始数据每种碱基含量约为25%，说明原始数据质量较高。经过质量控制后得到382 125 418个reads。将过滤后reads与小麦条锈菌基因组(PST－78，GenBank:AJIL00000000.1)比对，结果显示，4个样品数据的 71.15%～74.21%比对到了参考基因组上，其中单个定位的测序序列(Uniquely mapped reads)占总体(Clean reads)的百分比在70.14%～73.13%，多个定位的测序序列(Multiple mapped reads)占总体的百分比在 0.99%～1.16%。这些结果说明本研究所使用的测序数据真实可靠，能够保证分析结果的正确性。

图1 小麦条锈菌RNA

2.2 小麦条锈菌夏孢子形成时转录组的SSR分布

4个小麦条锈菌分离物转录组57.32 Gb的clean reads组装unigenes后，合并、去除重复的unigenes得到20 802条高质量unigenes，总碱基数为27 893 297 bp，平均每条unigene长约1 340 bp。根据1.2.2中所述条件进行SSR筛选，在2 941条unigenes中发现6 083个SSR位点。SSR发生频率(含有SSR的unigenes数目占总unigenes数目的比例)为14.13%，平均每9.84 kb出现1个SSR 位点，其中包含单个SSR位点的unigenes有1 615条，占含有SSR位点 unigenes总条数的 54.9%。1 326条unigenes含有1个以上SSR位点，其中绝大多数含有2～4个 SSR位点，6条 unigenes含有12个 SSR位点，含有14、15、20个SSR位点的unigenes各1条。

小麦条锈菌夏孢子形成时转录组SSR重复类型丰富，从单核苷酸重复到六核苷酸重复均有出现。6种重复核苷酸类型组成的SSR数量存在较大差异，以单核苷酸重复(2 575个)和三核苷酸重复(2 427个)所占比例较高，分别占SSR总数的42.33%和39.90%，分布频率(SSR数量/总unigenes数量)分别为12.38%和11.67%。总体上，二、四、五、六核苷酸重复类型的SSR数量依次递减，但六核苷酸重复类型的SSR数量大于五核苷酸重复类型的SSR数量。11个五核苷酸重复类型的SSR数量均为1个(表1)。

小麦条锈菌转录组中含有丰富的重复基序，不同重复类型的小麦条锈菌转录组SSR中有多种基序。单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复SSR出现的基序种类分别为4、10、56、44、11、19 种，共有 144 种。在本研究筛选的SSR中，单核苷酸重复的优势基序为T，占单核苷酸重复的60.00%，G重复类型所占比例最少。在三核苷酸重复基序中，优势基序有AAC、ATC、CAT，分别为301、140、138个，AAC重复类型的SSR所占比例最高，而TTG类型的SSR数量最少，仅有1个。五核苷酸和六核苷酸重复的SSR数量较少，二者加起来仅占 SSR总数的 0.53%，分布频率分别为0.05%和 0.10%(表 1)。

表1 小麦条锈菌夏孢子形成时转录组SSR重复类型分布特征

2.3 小麦条锈菌夏孢子形成时转录组SSR重复次数和基序长度

从重复次数上看，小麦条锈菌转录组SSR各重复类型的重复次数存在明显差异。除单核苷酸外，5、6次重复的SSR最多，分别为1 488个和1 016个，两者之和占总SSR个数的41.16%，7次重复的SSR有452个，占 7.43%，≥12次重复的 SSR个数为63个，所占比例仅为1.04%。表2中数据表明，随着重复次数的增加各重复类型SSR数量呈现出递减的趋势。二核苷酸重复的主要重复数为6～8次，三核苷酸重复的主要重复数为5～8次，四核苷酸重复的主要重复数为5～6次，五、六核苷酸重复的主要重复数为5次，说明随着核苷酸重复数的增加，同一重复类型的SSR总数也呈现变小的趋势。可见，基序重复次数的变异引起位点长度的变异是产生SSR多态性的主要原因。另外，分析数据表明，基序连续重复数最多的为三核苷酸 TAC，达 32次(unigene为PSTG－07600)，T基序连续重复可达31次(unigene为PSTG－16488)。六核苷酸基序的连续重复次数整体上大于五核苷酸，其中AAGGAG基序连续重复次数为15次(unigene为 PSTG－04191)，AAAACA(unigene为 PSTG－16928)和 CTCAAT(unigene为PSTG－14376)基序连续重复次数均为11次，而五核苷酸基序的连续重复次数最多为6次。

表2 小麦条锈菌夏孢子形成时转录组SSR各重复基序长度的重复次数分布特征 个

统计SSR长度分布发现，小麦条锈菌转录组SSR基序长度分布在10～435 bp，其中复合SSR的长度在22～435 bp，主要集中在 80～199 bp，共有934个，占总SSR个数的15.35%。除去复合 SSR，总体上小麦条锈菌转录组SSR基序长度分布在10～90 bp，12～20 bp基序长度的SSR数量最多(3 238个)，占总SSR个数的53.22%，大部分基序长度集中在 15 bp，10～11 bp的 SSR 有 1 390个，占 22.85%。大于20 bp的SSR数量较少，有521个，占8.6%(图2)。

图2 小麦条锈菌夏孢子形成时转录组SSR基序长度分布

2.4 小麦条锈菌夏孢子形成时转录组SSR引物筛选

选取 100对荧光引物对小麦条锈菌 CY31、CY32、CY33基因组 DNA进行 PCR扩增，ABI 3730XL检测结果显示，共有87对引物产生清晰、稳定的峰，即均有扩增产物。其中，75对引物扩增产物显示1个峰，12对引物显示2～4个峰，即2～4个等位基因。

3 结论与讨论

SSR标记传统开发方法是构建cDNA文库筛选，高通量测序技术为大规模筛选SSR标记提供了新的工具，例如从小麦条锈菌PST130基因组中发现1 889个SSR位点［9］。转录组是在特定的发育阶段和不同的生理条件下所有转录的RNA集合。利用转录组数据获得含有微卫星的序列，并用其进行遗传多样性研究在一些物种上已有报道。本研究利用小麦条锈菌夏孢子形成时的转录组数据大规模开发SSR标记位点，获得的SSR位点中除单核苷酸外，以三核苷酸重复基序为主要类型，与由小麦条锈菌基因组发掘的SSR位点中的主导类型为二、三核苷酸重复基序的结果一致［10］。而且，目前报道的小麦条锈菌SSR中的一部分与本研究发掘的SSR位点信息完全相同或相近。例如，Zhan等［10］报道的WSR7、WSR23、WSR90与本研究中相应SSR的重复基序、重复次数以及设计的引物对完全一致，WSR79、WSR95、WSR62、WSR85 等与本研究中相应SSR重复基序一致，与设计引物对的其中1条一致，说明利用小麦条锈菌转录组开发SSR引物是可行的。随机合成的100对引物中，有87对可以扩增出产物，说明设计的引物有效，在后续工作中需要加强开发在小麦条锈菌群体中具有多态性的引物。本研究设计的引物合成时进行了荧光修饰，该方法虽然费用比琼脂糖凝胶电泳检测略高，但筛选效率高，工作量相对较小，适合大规模筛选SSR引物。利用转录组开发的SSR位点可能与功能基因相关，由小麦条锈菌转录组开发的SSR中的一部分与由基因组发掘的SSR具有一致性，可能与该位点基因在小麦条锈菌中具有保守性有关。最近报道了小麦条锈菌中一个高度保守的效应子Puccinia NPR1 interactor(PNPi)，推测PNPi的高度保守性与小麦条锈菌在进化竞争中取得优势有关，改变PNPi蛋白结构可能影响小麦条锈菌的寄生适合度［14］。

通过分析小麦条锈菌夏孢子形成时转录组数据，配合荧光标记，可以批量筛选SSR引物，有望发现小麦条锈菌产孢过程中表达基因的等位位点变异，设计出更多的具多态性的SSR引物，还可能发现与小麦条锈菌产孢量密切相关的基因。目前，笔者正在利用多个小麦条锈菌分离物筛选本研究设计的SSR引物，筛选出的多态性引物加上已经报道的SSR引物可以应用在大范围的小麦条锈菌基因型和群体动态研究中。

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