刘超英，吴程华，高 洪，严玉霖，富国文，赵 汝(云南农业大学动物科学技术学院，昆明 650201)

耶尔森菌强毒力岛(The Yersinia High-pathogeniticity island，HPI)主要含有与摄铁有关的毒力基因簇[1-3]。研究表明，耶尔森杆菌HPI不仅可以通过Ybt的铁载体夺取宿主中的铁元素进而加重机体的感染，而且可在耶尔森菌和E.coli之间水平传播，与致病性E.coli的毒力进化有着密切的关系[4]。irp2基因是HPI中主要的功能基因，在铁缺乏的条件下可表达高分子量蛋白(High Molecular Weight Protein 2，HMWP2)。高分子量铁调节蛋白参与表达耶尔森杆菌素的阳性表型，被认为对铁载体耶尔杆菌素的合成有着非常重要的作用。因此，致病性E.coli的irp2基因缺失株的构建对致病机制的研究至关重要。

大肠杆菌基因敲除的传统方法是利用其自身的RecA同源重组系统编码的RecA和RecBCD蛋白介导DNA的同源重组。但因该系统存在重组效率低等较多缺点，目前主要采用更为简单迅速的Red同源重组系统的方法进行基因敲除[5-6]。利用该方法构建致病性大肠杆菌(PathogenicE.coli，PEC)HPIirp2基因缺失株，不仅为HPI毒力致病机理研究提供技术基础和理论依据，也为大肠杆菌病的防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料 质粒pKD46、pKD4、pCP20购自优宝生物，5株E.coli(A-E)分离株由实验室分离鉴定保存。试剂及试剂盒主要包括离心柱型质粒小提试剂盒、细菌基因组DNA提取试剂盒、DNA纯化试剂盒、2×power Taq MasterMix、Competent Cell Preparation Kit、Phusion Flash High-Fidelity PCR MasterMix、FastDigest DpnI限制性内切酶等。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA的提取和irp2基因的检测 利用细菌基因组DNA提取试剂盒的说明提取CVCC1565、E.coli(A-E)分离株培养液的DNA，产物保存在-20 ℃，作为PCR模版备用。根据irp2基因序列(GenBank登录号：L18881.1)的保守区域设计上下游引物，irp2-F(5'-3')：TTCCTTCAGCATCGCCTGTTA，irp2-R(5'-3')：CAAGCCCGACATACTCAATCT，由华大基因公司合成。……