王志宇，王国艳，薛俊龙，张伟业，孙仰介，刘 源

（山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西 太原 030032）

大肠杆菌因血清型复杂而又具较强变异性，接种疫苗效果不佳，因而在生产中多采用抗生素防治。近年来，随着抗菌药物的广泛、持续应用，大肠杆菌耐药水平随之提高，尤其是多重耐药菌株的出现，给抗菌治疗带来了困难，给养殖业造成了一定的经济损失[1-2]。大肠杆菌的多重耐药主要是由外膜通透性改变和主动外排系统共同作用的结果。其中，主要是外排泵系统（AcrAB-TolC）[3-8]与多重耐药有关。

本研究通过采集近年来山西各地不同的大肠杆菌菌株，在实验室分离纯化培养，筛选出30株多重耐药的菌株作为研究对象，选取影响大肠杆菌多重耐药的基因AcrA[9-11]，并结合喹诺酮类耐药基因qnrA[12-14]和 ESBLs（超广谱 β- 内酰胺酶）[15-16]相关耐药基因TEM[17-18]进行了初步分子生物学分析，旨在了解近年来山西省鸡源大肠杆菌的耐药机理，丰富山西省大肠杆菌病分子流行病学特征，也为今后生产实践中更好地防控大肠杆菌疫病奠定一定基础。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

病料采集于2016—2017年山西省部分地区疑似大肠杆菌病的病死鸡。细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，PCR扩增试剂购自Taraka宝生物（大连）；引物合成于生工生物工程（上海）股份有限公司；革兰阴性需氧菌鉴定板和肠杆菌药敏板购自上海复星佰珞生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 大肠杆菌的培养鉴定及药敏 从病料采集菌株并分离纯化，初步筛选革兰氏阴性杆菌，使用微生物鉴定药敏仪（上海复星佰珞）进行菌种鉴定和18种药敏判读。

1.2.2 相应基因的扩增 提取大肠杆菌基因组DNA作为模板，分别使用以下引物进行扩增，并对扩增结果进行测序及同源性比较。AcrA：上游引物为 5′-GACGACAAACAGGCCCAACA-3′，下游引物为 5′-TTAAGACTTGGACTGTTCA-3′；qnrA[19]：上游引物为 5′-CCAGGATTTGAGTGACAGC-3′，下游引物为 5′-TCCCAAGGGTTCCAGCA-3′；TEM[20]：上游引物为 5′-GGGGATGAGTATTCAACATTTCC-3′，下游引物：5′-GGGCAGTTACCAATGCTTAATCA-3′。

2 结果与分析

2.1 大肠杆菌药敏结果分析

药敏结果表明，30株鸡源性致病大肠杆菌对18种抗生素的17种产生不同程度耐药，其中，对β-内酰胺类药物高度耐药，耐药率达70%，对FQs类药物耐药率为60%（表1）。

对多重耐药进行统计，结果表明，30株大肠杆菌均表现多重耐药。其中，7株菌耐4种药，5株菌耐2种药，耐6种药和12种药的菌各3株。每株菌平均耐药6.5种，最少2种，最多14种（表2）。依据ELBLs判定方法，共计14株菌为ELBLs菌株。

表1 大肠杆菌对18种抗生素的药敏试验结果

表2 大肠杆菌多重耐药性结果

对多重耐药类型进行统计，山西各地采集到的30株鸡源大肠杆菌中，有23种多重耐药类型，其中，AMK-TZP-SAM-CZO和CIP-LVX的耐药型各4株，其他类型的多重耐药谱出现情况几乎无重复（表3）。

表3 大肠杆菌耐药谱型

2.2 多重耐药相关基因分析

以大肠杆菌基因组为模板，对AcrA基因片段的扩增结果如图1所示。

从电泳结果可以看到，所有菌株通过PCR均得到了AcrA基因片段，选取多重耐药菌株的PCR结果进行胶回收并连接T载体、测序。测序结果在NCBI进行序列比对，同源性达99%。对序列的编码蛋白进行分析，发现蛋白编码没有改变。由此可知，菌体中的AcrAB功能完整。

由图2可知，30株鸡源大肠杆菌中检测到符合目的基因（约592 bp）的共计11株，通过与药敏结果进行比对，扩增获得qnrA基因的菌株均对FQs类药物耐药；而另有7株不具备qnrA基因的菌株也对FQs耐药。在所有18株对FQs类耐药的菌株中，仅有4株单纯对FQs类耐药，其余14株均不同程度对其他药物也产生耐药。

对TEM基因片段的扩增结果表明，30株鸡源大肠杆菌中检测到符合目的基因（约861 bp）的共计4株（图3）。根据PCR结果和药敏结果综合分析，具有TEM基因的菌株均表现为ESBLs型。而14株ESBLs菌株中仅有4株TEM检出阳性，占28.5%。

3 讨论

本研究以30株鸡源致病性大肠杆菌作为试验组，对其进行药敏试验，结果表明，山西省鸡源致病性大肠杆菌已对喹诺酮类、氨基糖苷类药物产生高度耐药性。其中，喹诺酮类药物中，环丙沙星和左氟沙星耐药率均为60%。选取与之耐药有关的基因进行分析，菌体染色体中具有遗传耐药性的已达61%，这是由喹诺酮类药物在长期的使用过程中导致菌体基因突变等原因造成的。

氨基糖甙类平均耐药率已达到55%，该类药物在生产实践中已存在长期普遍性耐药。遗传耐药性已较为广泛。

而头孢类药物耐药情况表现为，对第1代头孢（头孢唑林）的耐药性较高，耐药率达到70%；而对2，3，4代头孢的耐药率平均为26.6%。在对相关基因进行分析后发现，具有可遗传性耐药的仅占28.5%，其余大部分是由于用药环境不当（如抗生素的长期使用、不规范使用等）激发菌体主动外排机制活跃而引起，这种情况在用药环境改善后会逐步消除。

从山西省鸡源致病性大肠杆菌耐药情况来看，喹诺酮类和氨基糖甙类由于耐药水平较高且具有较高遗传性，因而在实际生产中建议不作为首选用药。头孢药物中除一代头孢外，均对菌体具有一定的药物敏感性，且其中具有遗传性耐药的比率很低，可作为首选用药推荐使用。

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