童垣皓，蒙龙锡宇，赵亚蓉，沈苏南，赵树立，窦环

（1.南京大学医学院，江苏南京 210093）（2.南京市第一医院，江苏南京 210006）

酒精性肝病(Alcoholic liver disease，ALD)是指过度饮入酒精而造成的肝脏疾病。根据发病程度的不同，可将ALD分为4个类型，分别是酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化[1]。随着现代社会的发展和人类饮食结构的改变，ALD已经成为世界范围内慢性肝病的最重要起因之一，其流行病学调查资料显示在我国南方及中西部地区，成人群体ALD患病率为4.3%～6.5%，是我国最常见的肝脏疾病之一[2]。

ALD的发病机制十分复杂，氧化应激是酒精性肝损伤发生的主要机制。乙醇主要在肝脏中代谢，在其代谢过程中会产生大量的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)[3]。ROS介导的脂质过氧化会损伤生物膜，除了对肝细胞有直接损伤外，还会破坏线粒体的正常结构，影响脂肪酸的β氧化，机体脂代谢发生紊乱，脂肪在肝细胞内大量堆积形成脂肪肝，导致血清脂代谢相关指标变化，这可能与脂代谢相关通路基因表达水平的变化有关[4]。此外，酒精性肝损伤的发生还与肠道菌群失调有密切的关系。过量酒精摄入能增加肠道的通透性，导致肠道屏障功能减弱，革兰氏阴性菌大量繁殖，内毒素大量入血，血浆中大量的内毒素到达肝脏后激活肝血窦内的巨噬细胞Kupffer细胞，引起炎症反应，释放大量炎症因子和ROS，加重氧化应激的损伤作用[5～8]。通过改善肠道菌群失调进而治疗酒精性肝病是当前的研究热点之一。

益生菌(Probiotics)，又译为原生保健性菌种，是指可改善宿主(如动物或人类)肠内微生态的平衡，并对宿主有正面效益的活性微生物，主要是指双歧杆菌和乳酸菌等。研究显示，益生菌对人体有许多正面的效益，例如治疗腹泻，改善乳糖不耐受，提高人体免疫力，对抗生殖系统和泌尿系统感染等[9]。1994年，Nanji等[10,11]首先发现鼠李糖乳杆菌Lactobacillus GG干预能够缓解酒精灌胃大鼠造成的内毒素血症和肝损伤，此后越来越多的动物实验证实，补充不同种类的益生菌能在一定程度上缓解酒精性肝损伤。梁慧等[12]以益生菌发酵乳(包含保加利亚乳杆菌、乳双歧杆菌及嗜热链球菌)为干预物进行实验，结果表明益生菌对大鼠酒精性肝损伤的保护作用可能够通过调节肠道菌群、修复肠道屏障功能等实现。因此，对ALD患者来说，利用益生菌制剂重建肠道微生态的平衡被认为是一项可行的治疗方法。

本实验所使用的四联活菌制剂Bornlisy(BO)是由保加利亚乳杆菌、幼儿双歧杆菌、芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌有机混合开发研制而成，其中芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌对ALD的保护作用还不甚明确，因此实验结果可能在调节ALD患者的肠道菌群谱上具有一定参考价值。

此外，虽然目前保加利亚乳杆菌等益生菌对ALD的缓解和治疗作用已经有所体现，但其具体的作用机制仍未明确，需要进一步的探索。开展本研究的目的即评估四联活菌制剂BO缓解酒精性肝损伤的疗效，并帮助明确益生菌制剂缓解酒精性肝损伤的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

四联活菌制剂BO，分别含有等量的由保加利亚乳杆菌、幼儿双歧杆菌、芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌，活菌含量均为2亿/mL，由南京伯恩利施生物科技有限公司提供；56度二锅头，北京红星股份有限公司；SPF级♂BALB/c小鼠(20～26 g)(南京大学-南京市生物医药研究院，实验动物许可证号：SCXK(苏)2015-0001)。丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)检测试剂盒，南京建成生物工程研究所；PCR引物，南京思普金生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

MM400混合球磨仪(德国RETSCH)；5810R冷冻离心机(德国eppendorf)；HERAEUS FRESCO17冷冻微量离心机(德国Thermo)；DRP-9082电热恒温培养箱(上海森信)；Heto Ultra Freeze超低温冰箱(美国Thermo)；多功能微孔板检测仪(美国BioTek)；T100TM梯度PCR仪(美国BIO-RAD)；SmartSpecTM PLUS核酸蛋白质测定仪(美国BIO-RAD)；LineGene 9640荧光定量PCR仪(杭州博日)；ZY220全自动生化分析仪(上海科华)。

1.3 实验动物模型与处理

1.3.1 急性酒精性肝损伤模型

将小鼠适应性喂养5 d后，随机分为对照组、酒精模型组、BO治疗组、BO上清治疗组，每组6只。模型组每次给予10 mL/kg蒸馏水灌胃0.5 h后给予56 °红星二锅头配制而成的50%乙醇10 mL/kg灌胃；BO治疗组每次给予BO制剂10 mL/kg灌胃，BO上清治疗组每次给予BO上清液(BO制剂4000 r/min离心5 min所得)10 mL/kg灌胃，0.5 h后给予BO治疗组和BO上清治疗组等量的30%乙醇灌胃；对照组每次给予10 mL/kg蒸馏水灌胃0.5 h后再次给予同等剂量蒸馏水灌胃。每2 d灌胃一次，共进行三次。

1.3.2 慢性酒精性肝损伤模型

小鼠分组与处理方法如表1所示。将小鼠适应性喂养5 d后，随机分为对照组、酒精模型组、BO治疗组、BO上清治疗组，每组8只。模型组每日给予10 mL/kg蒸馏水灌胃0.5 h后给予56 °红星二锅头配制而成的30%乙醇10 mL/kg灌胃；BO治疗组每日给予BO制剂10 mL/kg灌胃，BO上清治疗组每日给予BO上清液(BO制剂4000 r/min离心5 min所得)10 mL/kg灌胃，0.5 h后给予BO治疗组和BO上清治疗组等量的30%乙醇灌胃；对照组每日给予10 mL/kg蒸馏水灌胃0.5 h后再次给予同等剂量蒸馏水灌胃。持续56 d。

表1 小鼠分组与处理Table 1 Grouping and treatment of the mice

1.4 血清转氨酶、甘油三酯、总胆固醇和脂蛋白测定

使用全自动生化分析仪检测血清中ALT活力与TG、HDL、LDL含量。其中ALT活力以U/L血清表示，TG、HDL、LDL含量以mmol/L血清表示。

1.5 肝脏系数测定

小鼠肝脏吸干血水后，按照下列公式计算肝脏系数：肝脏系数(%)=肝重(g)/体重(g)×100%。

1.6 肝脏超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和丙二醛含量测定

MDA含量采用TBA法测定，结果以nmol/mg protein表示；SOD活力采用WST-1法测定，结果以U/mg protein表示；GSH-Px活力采用比色法测定，结果以U/mg protein表示。以上操作步骤严格按试剂盒说明书进行。

1.7 肝组织病理检查-H&E染色法

将新鲜肝组织用中性甲醛固定，常规石蜡包埋、切片、脱蜡，然后经水化和染色，最后采用光学显微镜和成像系统进行肝脏病理变化观察。

1.8 定量PCR(Real time Quantitative PCR，qRT-PCR)测定mRNA水平

取100 mg肝脏组织块，制备肝脏组织匀浆，提取小鼠肝脏mRNA。取0.5 g提取得到的mRNA，经RT后逆转录得到cDNA。所得cDNA采用SYBR Green法进行qPCR测定mRNA水平。所用引物序列如表2所示。

表2 不同基因 PCR 引物序列Table 2 PCR primer sequences of different gene

1.9 肝组织病理检查-H&E染色法

实验数据采用Prizsm 5利用软件的t test进行统计学分析，各项指标以平均值±标准差(x±s)表示，p<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与讨论

目前关于酒精性肝损伤的研究大多仅侧重于急性或慢性两者之中的其中一个方面，在本实验中，我们先建立了小鼠急性酒精性肝损伤模型初步评估BO制剂的治疗效果，之后进一步建立慢性肝损伤模型进行实验，将四联活菌制剂BO对急性和慢性酒精性肝损伤的疗效均进行了探讨，总结如下：

2.1 急性酒精性肝损伤模型

各组小鼠的生存率见图1，急性酒精性肝损伤造模后模型组小鼠生存率降至16.67%，而BO治疗组小鼠生存率为83.33%。与对照组相比，模型组小鼠生存率显著下降(p<0.01)。与模型组小鼠相比，BO治疗组的生存率显著上升(p<0.05)而BO上清治疗组生存率虽有上升趋势，但无显著差异(p>0.05)。初步结果表明BO治疗可显著提高急性酒精性肝损伤小鼠的生存率(p<0.01)，对酒精性肝损伤模型小鼠有保护作用，而BO上清治疗组则无上述效果。

图1 急性酒精性肝损伤模型生存曲线Fig.1 Survival curve of acute alcoholic-induced liver injury model

2.2 慢性酒精性肝损伤模型

2.2.1 小鼠体重、肝重和肝脏指数

各组小鼠的体重、肝重和肝脏指数见表2。各组小鼠初体重、终体重和肝重无显著性差异(p>0.05)。与对照组相比，模型组小鼠肝脏指数显著上升(p<0.05)。与模型组小鼠相比，BO治疗组的肝脏指数显著下降(p<0.05)，而BO上清治疗组肝脏指数虽有下降趋势，但无显著差异(p>0.05)。由于各只小鼠的体重不同，仅用肝重进行横向比较缺乏严谨性，因此运用肝脏指数进行比较更为合理。模型组小鼠肝脏指数的上升表明模型组小鼠肝脏出现肿大，BO制剂治疗后抑制了肝脏指数的上升，减轻了肝脏的肿大。

表3 小鼠体重、肝脏重量和肝脏指数(肝重/体重×100%)Table 3 Mice body weight, liver weight and liver index (liver weight/ body weight×100%)

2.2.2 BO干预对小鼠肝脏功能的影响

图2 BO干预对小鼠肝脏功能的影响Fig.2 Effects of BO intervention on mouse liver functions

酒精性脂肪肝作为酒精性肝病的初期表现，是肝脏发生损伤后的结果，脂代谢紊乱是其发生发展的主要原因之一。

如图2所示，与对照组相比，模型组小鼠血清ALT含量升高了366.15%(p<0.001)；与模型组相比，BO治疗组的ALT含量下降了46.37%(p<0.001)，BO上清治疗组的ALT含量无显著变化(p>0.05)。与对照组相比，模型组血清TG的含量上升了36.83%(p<0.05)，血清HDL含量下降了4.87%，血清LDL含量上升了4.55%(p>0.05)；与模型组相比，BO治疗组的TG含量下降了17.81%(p<0.05)，表明BO制剂干预显著抑制了TG含量的上升，同时抑制血清HDL含量的下降和LDL含量的上升，但无显著差异(p>0.05)。与模型组相比，BO上清治疗组的TG含量基本无差异，血清HDL含量有所上升，LDL含量有所下降，但无显著差异(p>0.05)。以上结果显示，慢性酒精性肝损伤可引起ALT活力的升高，脂代谢功能发生紊乱。BO制剂干预后，脂代谢相关指标趋于正常，提示BO制剂可能是通过影响脂代谢相关通路发挥治疗作用。

2.2.3 BO干预对小鼠肝脏组织病理变化的影响

图3 小鼠肝脏组织H&E染色光镜像(×400)Fig.3 H&E staining light microscope images of mice liver tissues (×400)

如图3所示，组织病理检查结果显示对照组小鼠肝小叶在镜下结构清晰，肝细胞形态大小规整，肝索排列整齐，以中央静脉为中心大致呈放射状排列；模型组小鼠肝脏内脂肪大量蓄积，表现为H&E染色下肝细胞内出现大量脂肪空泡，呈弥散性脂肪变，肝细胞肿胀明显，肝索排列紊乱，肝血窦狭窄充血；BO治疗组小鼠肝脏与模型组相比肝细胞大小基本正常，脂肪空泡明显减少，脂肪变有所缓解，肝索排列较为整齐，肝血窦清晰，整体接近于对照组，提示制剂治疗有一定效果；BO上清治疗组小鼠肝细胞内仍可见大量脂肪空泡，肝细胞肿胀明显，肝索排列仍紊乱，肝血窦狭窄充血，其与模型组相比未见明显改善，提示制剂上清组治疗效果不理想甚至基本无效果，表明BO制剂干预后能在一定程度上改善脂代谢紊乱的情况。

2.2.4 BO干预对小鼠肝内MDA、SOD、GSH-Px水平的影响

图4 BO干预对小鼠肝内MDA、SOD和GSH-Px水平的影响Fig.4 Effects of BO intervention on the levels of MDA,SOD and GSH-Px in mice livers

氧化应激在酒精性肝损伤的进展中发挥重要作用，肝细胞的损伤与自由基的产生密切相关。饮酒后，乙醇被乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase，ADH)、细胞色素P4502E1(CYP2E1)氧化为乙醛，乙醛由乙醛脱氢酶(acetaldehyde dehydrogenase，ALDH)转换为乙酸，导入三羧酸循环生成乙酰辅酶A，在这一代谢过程中会产生大量的ROS[15]。同时乙醇暴露会引起内毒素血症，血浆中大量内毒素到达肝脏后激活Kupffer细胞也会产生一定量的ROS。ROS的大量生成会打破肝细胞内氧化与抗氧化之间的相对平衡，进而使肝细胞中发生脂质过氧化损伤，降低抗氧化酶促防御体系中的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)的活力，增加脂质过氧化产物如丙二醛(malondialdehyde，MDA)的形成[16]。

如图4所示，模型组小鼠肝脏的氧化应激水平显著增强，表现为氧化应激marker分子MDA含量显著增加，以及抗氧化酶SOD和GSH-Px活力显著减少。与对照组相比，模型组小鼠肝内MDA含量上升了17.40%(p<0.05)，SOD活力下降了28.34%(p<0.01)，GSH-Px活力下降了83.35%(p<0.001)；与模型组相比，BO治疗组MDA含量下降了9.09%(p>0.05)，SOD活力上升了43.30%(p<0.05)，GSH-Px活力上升了281.44%(p<0.01)，表明BO制剂干预有效地抑制了MDA含量的增加和SOD、GSH-Px活力的下降。与对照组相比，BO上清治疗组的GSH-Px活力上升了170.65%(p<0.05)，对MDA和SOD则无显著作用。结果表明BO制剂干预后可通过提高抗氧化酶的活力，减少脂质过氧化产物的生成，缓解酒精暴露引起的氧化应激对肝细胞的损伤。

2.2.5 BO干预对小鼠肝脏组织SREBP-1c通路相关基因mRNA表达的影响

图5 BO干预对SREBP-1c通路的影响Fig.5 Effects of BO intervention on SREBP-1c pathway

固醇调节元件结合蛋白1c(sterol regulatory element-binding protein-1c，SREBP-1c)，是肝细胞内调控脂肪酸合成的重要转录调节因子，能够调控FAS等生脂酶的活性。FAS即脂肪酸合成酶，与脂肪酸的合成密切相关，SREBP-1c能够提高FAS的活性从而调控脂肪酸代谢[17]。有研究表明，乙醇暴露会导致SREBP-1c的mRNA水平上升，进而使FAS活化[18～20]，脂肪酸合成增加，加速脂肪肝的形成。

如图5所示，与对照组小鼠相比，模型组小鼠肝组织中SREBP-1c、FAS的mRNA水平均显著升高(p<0.01)。然而BO及BO上清干预后对于SREBP-1c、FAS的mRNA水平影响不显著(p>0.05)，表明BO制剂可能不是作用于SREBP-1c通路而起到治疗作用。

2.2.6 BO干预对小鼠肝脏组织PPARα通路相关基因mRNA表达的影响

图6 BO干预对PPARα通路的影响Fig.6 Effects of BO intervention on PPARα pathway

过氧化物酶体增殖剂激活受体(peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs)包含PPARα、PPAR β/δ和PPARγ三种亚型，其中PPARα是在肝细胞内高表达的一种调控脂肪酸氧化分解代谢的核转录因子，可调控多种靶基因的表达，包括参与脂代谢几乎所有过程如脂肪酸摄取、结合与氧化，脂蛋白组合、运输与代谢的基因，是脂代谢关键的调节因子[21～23]。酰基辅酶A氧化酶1(acyl-CoA oxidase 1，ACOX1)和肝脏脂肪酸结合蛋白(liver fatty acid-binding protein，L-FABP)是PPARα的下游靶基因[24,25]。ACOX1主要调节脂肪酸在线粒体和过氧化物酶体中的β氧化过程，促进脂肪酸的代谢，是脂肪酸β氧化的关键限速酶[26]。L-FABP是一族多源性的小分子胞内蛋白质，其主要作用是调节脂肪酸的摄取和胞内运输，可将脂肪酸从细胞膜上运送到脂肪酸氧化和甘油三酯及磷脂合成的场所[27]。上述三者可共同介导脂肪酸在肝细胞内的氧化代谢。并有研究显示，乙醇暴露能够抑制PPARα的转录活性及其调控的某些靶基因的表达[28～30]。

如图6所示，与对照组小鼠相比，模型组小鼠肝组织中PPARα和L-FABP的mRNA水平极显著降低(p<0.001)，ACOX1的mRNA水平显著降低(p<0.05)；与模型组相比，BO制剂干预则抑制了PPARα、ACOX1和L-FABPmRNA水平的降低(p<0.05)，表现为三者的mRNA水平显著提高；而BO制剂上清干预后对于PPARα、ACOX1的mRNA水平无显著影响(p>0.05)，但对对于L-FABP的mRNA水平有一定影响(p<0.05)。这些结果表明BO制剂干预能够有效抑制PPARα、ACOX1 和L-FABP转录活性的降低。综合以上结果，提示BO制剂可能是通过选择性调控PPARα通路相关基因的表达缓解脂代谢紊乱，对酒精性肝损伤起到保护作用。

2.2.7 BO上清干预对小鼠的影响

在本实验中我们还设法探究了BO制剂上清液的治疗作用。BO制剂上清液是由BO制剂4000 r/min离心5 min所得，所弃沉淀为深褐色块状固体。实验结果显示，与BO制剂组相比，BO制剂上清治疗组无显著的治疗效果。病理切片显示，BO制剂上清治疗组小鼠肝细胞内仍可见大量脂肪空泡，肝细胞肿胀明显，肝索排列仍紊乱，肝血窦狭窄充血，与模型组相比未见明显改善，并且其所测各项生化指标及基因表达水平与模型组相近。推测原因可能是所弃沉淀含有大量的菌体成分，而菌体成分是发挥治疗作用的主要因素，所以BO制剂上清的治疗作用不甚理想。

3 结论

3.1 长期大量摄入酒精可引起肝损伤，表现为肝脏肿大，肝指数上升，肝细胞肿胀、脂肪变，伴有血清学指标的改变，如血清谷丙转氨酶(ALT)活力的升高(p<0.001)、脂代谢相关通路的基因表达水平发生改变，表现为肝组织中SREBP-1c通路相关基因mRNA水平的升高以及PPARα通路相关基因mRNA水平的显著降低。BO制剂干预能显著提高急性酒精性肝损伤小鼠的生存率(p<0.05)。对于慢性酒精性肝损伤小鼠，BO制剂干预能缓解小鼠肝脏的肿大，减轻肝组织病理学改变，显著降低血清ALT活力，降低血清TG和LDL的含量，升高血清HDL的含量，并可降低脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量，显著升高超氧化物岐化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活力。同时，BO制剂干预后显著抑制了PPARα、ACOX1和L-FABP mRNA水平的降低，肝组织病理检查也显示肝细胞损伤有所缓解。综合以上结果，BO制剂对酒精性肝损伤具有保护作用，作用机制可能与提高肝组织的抗氧化能力，抑制脂质过氧化，缓解酒精暴露引起的氧化应激对肝细胞的损伤，并选择性地调控与脂代谢相关的PPARα通路相关基因的表达，缓解脂代谢紊乱有关。

3.2 现今益生菌制剂对于酒精性肝损伤的保护作用在许多研究中已得到初步体现，但大多数研究还停留在乳杆菌、双歧杆菌等单一或两种菌体治疗效果的探究，对于多种菌种联合应用的研究还少之又少。本实验采用的BO制剂为一种四联活菌制剂，对于复杂的肠道微生态而言，多种益生菌之间潜在的相互协同作用以及其对肠道菌群的影响或许对酒精性肝损伤有着更好的疗效，可能在未来为ALD的防治提供一种更加切实有效的方法和途径。

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