周兴华，张晓伟，肖香，周越，赵延胜，祝莹，张家艳，董英

（江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江 212013）

双酚A(BPA)自1960年工业化生产后，由于其加工材料无色透明、轻便及耐腐蚀等优点，被广泛应用于食品塑料包装材料、金属内涂层及供水管的制造等[1]。但是由于BPA具有环境内分泌干扰物的性质，其安全性一直受到质疑[2～7]。目前为止，中国、欧美、美国等国家已经禁止了BPA在婴幼儿奶瓶的使用，法国禁止了BPA在所有食品包装材料的应用[8]，人们把目光转向了与BPA结构高度相似的双酚S(BPS)[9]，于是BPS作为替代品广泛应用于各种食品包装材料中。与此同时，BPS的产量每年都在增加，Liao等[10]研究发现在美国及7个亚洲国家（中国、印度、日本、韩国、科威特、马来西亚和越南）的315份尿样检查报告中，其中81%的样品检出了双酚S，而且随着BPS替代使用范围的扩大，人群暴露量会更大。尽管BPS具有更好的化学稳定性，但与BPA相比，具有更强的皮肤渗透性，更好的吸收率，可能造成更重的人体负担[10～13]。体内及体外实验表明，BPS及其代谢中间体具有抗雌激素或甲状腺激素作用[14]，还能引起大鼠生殖系统的损伤，影响睾丸及附睾病理形态学特征及精子形成[15]。目前BPS在应用之前并没有对其毒理学进行充分研究，因此BPS的安全性问题越来越受到关注[9]，尤其是BPS的低毒性效应。秀丽线虫（Caenorhabditis elegans，C.elegans）是一种能够在土壤中自由生活的，常见的小型线虫，成虫体长约在1 mm左右，以细菌为食，与其他模式生物相比，具有体积小、繁殖能力强、易于培养、成本低、易保藏、传代快和身体透明等特点，秀丽线虫对外源化合物十分敏感，因此也是毒理学评价中的经典模式生物[16]。本实验以BPS为研究对象，秀丽线虫为模式生物，研究BPS暴露对秀丽线虫的急性毒性、运动行为指标、寿命及子代数目的影响，为BPS在食品包装材料中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器设备

BPS，美国Sigma公司；活性氧ROS试剂盒，南京生物建成生物有限责任公司；其他生化试剂，国药集团化学试剂有限责任公司。体视显微镜，南京江南永新光学有限公司；多功能酶标仪，帝肯（上海）贸易有限公司。

1.2 秀丽线虫的培养

秀丽隐杆线虫N2野生型，东南大学王大勇实验室惠赠。

1.3 秀丽线虫的同步化

将大量处于产卵期的雌雄同体的秀丽隐杆线虫成虫从NGM固体培养基冲洗下来，加入1 mL的裂解液，裂解5 min，3000 r/min离心1.5 min，弃上清，得到沉淀的虫卵。反复清洗3次，以充分去除裂解液成分。最后将虫卵转移到涂有新鲜食物的NGM培养基上，在20 ℃培养箱中培养。

1.4 实验设计

根据试验设计配制浓度分别为100、10、1、0.1、0.01、0.001、0 mM的BPS染毒液，染毒液中乙醇的终浓度全部为0.1%。将处于L4期的秀丽隐杆线虫分别转移到含有不同浓度染毒液的培养基中，进行急性毒性暴露，24小时后进行各项指标测定。

时间一分一秒地过去，激荡在内心的愤恨盛怒已消失殆尽，恐慌焦虑悄然爬上心头。昨天老四曾嘱咐我们要善于发现对手的弱点，但皮特除了缺乏讨喜的品质外，没有任何弱点。他够高够强壮，块头大，但又没有大到使行动迟缓；他对别人的弱点有很好的判断力；他生性恶毒，肯定不会对我有半点慈悲心。我本想理直气壮地告诉他不要小瞧我，可这分明是个谎言。皮特猜得一点没错，我真是一点打斗能力都没有。

1.5 指标测定

1.5.1 运动行为指标的测定

首先，针对跨区域活动的趋势，我国应当尽快在中央建立专门的反黑领导机构，再组建一支国家级的打黑专业队伍。这支队伍的主体应当从公、检、法抽调精兵强将组成，并相对独立于各政法部门，直接对反黑领导机构负责，再辅之以法律、金融等相关行业的专家组成顾问团，主要负责全国反黑情报的收集、研判、立案、流转、指导等工作。［20］这种做法的优势在于，可以从中央层面掌握和分析全国有组织犯罪态势，制定宏观的打击战略和方针，协调各执法部门工作，统筹打击力量，确保打击效果;相对独立和高级别的机构也能较少受到“保护伞”的干扰，有利于深挖国家公职人员中的“内线”。［21］

将暴毒后的线虫依次挑起置于没有涂布大肠杆菌的NGM培养基上，在体式显微镜下观察。记线虫身体向前走过一个波长为一次身体弯曲，记录30 s内线虫的身体弯曲次数。

头部摆动频率：滴取适量M9于载玻片上，挑取暴毒后的线虫于M9液滴中，在体式显微镜下观察，头部摆动频率的标准为1 min内头部从一侧摆到另一侧再摆回来的次数。

回顾世界经济发展的脉络可见，试图打造在资源配置中统管一切的全能政府是不切实际的。因为，全能政府模式是通过行政权的运用来达致经济决策与执行的高度统一，而不是考虑如何通过市场促进社会经济的协调发展。与此相反，负面清单管理模式以一种相对消极的权力模式对待新的经济发展形态，主动将管理权部分地让渡给社会民众，通过社会民众自发自为的管理替代强力约束。但是，如若一味地追求无为而过度推崇负面清单模式，也可能会产生混乱。

暴毒结束后，在涂有大肠杆菌OP50的NGM培养基上挑1只待产卵的线虫，并保证在产卵期内每天将线虫转移到新的NGM培养基内，含有虫卵的旧平板继续放置培养箱内培养24 h，然后对每个平板内的线虫的数目进行统计、相加。等到线虫的排卵期结束后，计算每条线虫总的子代数目。

1.5.4 活性氧自由基[17]的测定

1.5.1.1 头部摆动频率

总而言之，化学实验是初中化学教学的重要组成内容，其作用是其他教学所无法替代的。在初中化学实验课堂教学中，教师必须不断改进教学观念，发展教学理念，用素质教育理念作为教学的指导思想，推动初中化学实验教学效果的不断提升，实现初中生综合素养的均衡提高。

线虫的寿命是指从线虫的卵开始直到死亡的这段时间。

2、选择利用 ISO国际标准指纹模块AS608指纹模块集成了光路和指纹处理部分的一体化指纹处理模块，体积小、功耗低、接口简单可靠性高识别速度快等特点，对于干湿手指均有相应快的特点。

1.5.3 寿命的测定

暴毒结束后，每个浓度挑取50只待测线虫至Costar 24孔板内，然后每个孔内分别加入ROS试剂，使荧光探针CM-H2DCFDA的终浓度为1 μmol/L。在无菌生化培养箱内培养2 h后取出处理后的受试线虫，用M9缓冲液冲洗3次，以去除残留的ROS试剂。用多功能酶标仪来检测各个浓度的受试线虫的ROS水平，激发波长和发射波长分别设置为485 nm和535 nm，读出ROS的平均荧光强度。ROS水平的单位定义为相对荧光强度/50条受试线虫。

1.5.2 子代数目的测定

1.5.1.2 身体弯曲频率

暴毒结束后，将秀丽隐杆线虫挑到新的培养基上，产卵期内每天将线虫转移到新的平板上，后期每两天转移一次。

1.6 统计分析

利用origin 8.5对结果进行统计分析，并用SPSS做显著性分析，与对照组相比较，显著水平设定为*p<0.05和**p<0.01。

2 结果与分析

2.1 BPS急性暴毒对秀丽隐杆线虫运动行为的影响

图1 BPS急性暴露对秀丽隐杆线虫运动行为的影响Fig.1 Effects of BPS acute exposure on the movement behavior of C. elegans

图1显示了不同浓度的BPS急性暴露对秀丽隐杆线虫运动行为的影响。如图所示，当BPS浓度达到10 μmol/L时，秀丽线虫的头部摆动频率显著下降（p<0.01）。BPS浓度为100 μmol/L时，与对照组相比，头部摆动频率下降13.49%。而当BPS浓度达到1 μmol/L时，秀丽线虫的身体弯曲频率显著下降（p<0.05），BPS浓度为100 μmol/L时，与对照组相比，身体弯曲频率下降23.64%。研究表明，BPS可以显著地抑制秀丽线虫运动行为能力，BPS浓度越高，秀丽线虫的运动行为能力抑制越显著。

2.2 BPS对寿命的影响

图2显示了不同浓度的BPS对秀丽线虫的寿命的影响。如图所示，与对照组相比，当BPS浓度达到0.001 μmol/L时，秀丽线虫的寿命显著降低（p<0.01）。BPS浓度越高，秀丽线虫寿命的负面影响越显著。BPS浓度为100 μmol/L时，与对照组相比，寿命下降35.42%。研究表明，BPS可以显著降低秀丽线虫的寿命，并与浓度呈现出一定的线性关系。

2.3 BPS对秀丽隐杆线虫子代数目的影响

不同浓度的BPS对秀丽线虫子代数目的影响如图3所示，与对照组相比，浓度越高，子代数目下降越明显。BPS为10 mol/L时，与对照组相比，秀丽线虫子代数目下降28.13%，浓度为100 μmol/L时，子代数目下降30.47%。研究表明，BPS可以显著影响秀丽线虫的子代数目。

就能得出奇异值差分谱序列的峰值谱N,以及相应的重构阶数.如差分谱峰值dk,以角标数字k找出奇异值序列中的对应峰值σk,即在k值前的奇异值变化较大,而之后的奇异值将接近于某一值后稳定.说明峰值σk是信号与噪声的分界点,此时取k值前的奇异值重构信号,该信号就是降噪处理后的真实振动特征数据.

图2 BPS急性暴露对秀丽隐杆线虫寿命的影响Fig.2 Effects of BPS acute exposure on the lifespan of C. elegans

图3 BPA急性暴露对秀丽隐杆线虫子代数量的影响Fig.3 Effects of BPS acute exposure on the brood size of C.elegans

2.4 BPS对秀丽线虫ROS的影响

图4 BPS急性暴露对秀丽线虫ROS水平的影响Fig.4 Effects of BPS acute exposure on ROS level of C. elegans

图4显示了不同浓度BPS急性暴露对秀丽线虫ROS水平的影响，如图所示，与对照组相比，BPS浓度达到0.01 μmol/L时，秀丽线虫的ROS水平显著升高（p<0.01）。BPS浓度越高，ROS水平越高。BPS浓度为100 μmol/L时，与对照组相比，ROS水平升高了776.64%。研究表明，BPS可以显著升高秀丽线虫ROS水平，推测BPS可能通过氧化应激途径进而损害秀丽线虫。

3 结论

随着BPA逐渐进入公众的视野，其安全性备受质疑，很多食品包装材料及婴幼儿奶瓶也打上了“无BPA”的字眼，却使用了另外一种结构高度相似的化合物BPS，然而关于BPS的毒理学研究甚少，尤其是以秀丽线虫作为模式生物，目前仅有两篇相关报道[1,18]。本论文研究了BPS急性暴露对秀丽线虫毒性作用，选取了不同的低浓度水平分析BPS对秀丽线虫运动行为、生长发育及繁殖能力的影响。研究发现，当BPS浓度达到1 μmol/L时，BPS显著性的抑制了秀丽线虫的运动行为能力，其中头部摆动频率和身体弯曲频率显著下降，同时子代数量也在下降。Mersh等[1]研究了BPS胚胎期暴露对秀丽线虫的非联合型学习能力，研究发现，与对照组相比，浓度达到0.1 μmol/L时，对秀丽线虫刺激次数显著性增加，也就是说，低浓度的BPS也能影响秀丽线虫的习惯化学习能力，需要更多的外部刺激才能使秀丽线虫适应环境的变化，推测这种习惯化学习行为的改变可能是BPS与雌二醇结构的相似性，干扰了神经细胞突触可塑性的变化，进而影响了秀丽线虫的学习记忆及运动行为能力[19]，研究也发现浓度超过1 μmol/L时，子代数量也在显著降低。Chen等[18]研究了BPS对秀丽线虫的生殖细胞及繁殖功能的影响，结果发现BPS和BPA均能引起的生殖系统损伤，增加生殖细胞的凋亡，导致胚胎致死率上升，而研究也发现，BPS和BPA可能是通过不完全相同途径作用生殖系统。我们研究还发现，低浓度的BPS能够显著缩短秀丽线虫的寿命，促进ROS的生成，推测ROS的过度产生可能是加速秀丽线虫的衰老的主要原因。

[1] Mersha M D, Patel B M, Patel D, et al. Effects of BPA and BPS exposure limited to early embryogenesis persist to impair non-associative learning in adults [J]. Behavioral &Brain Functions, 2015, 11(1): 27

[2] Miyawaki J, Sakayama K, Kato H, et al. Perinatal and postnatal exposure to bisphenol a increases adipose tissue mass and serum cholesterol level in mice [J]. Journal of Atherosclerosis & Thrombosis, 2007, 14(5): 245

[3] Moral R, Wang R, Russo I H, et al. Effect of prenatal exposure to the endocrine disruptor bisphenol A on mammary gland morphology and gene expression signature [J]. Journal of Endocrinology, 2008, 196(1): 101

[4] Zhang X, Chang H, Wiseman S, et al. Bisphenol A disrupts steroidogenesis in human H295R cells [J]. Toxicological Sciences An Official Journal of the Society of Toxicology,2011, 121(2): 320

[5] Rochester J R. Bisphenol A and human health: a review of the literature [J]. Reproductive Toxicology, 2013, 42(12):132-155

[6] Rezg R, Elfazaa S, Gharbi N, et al. Bisphenol A and human chronic diseases: current evidences, possible mechanisms,and future perspectives [J]. Environment International, 2014,64(3): 83

[7] Rubin B S, Paranjpe M, Dafonte T, et al. Perinatal BPA exposure alters body weight and composition in a dose specific and sex specific manner: the addition of peripubertal exposure exacerbates adverse effects in female mice [J].Reproductive Toxicology, 2016, 68: 130-144

[8] Amat E, Rihouey-Robini L. Bisphenol A in January 2015:French prohibition and EFSA study [J]. European Food and Feed Law Review, 2015, 10(2): 138-138

[9] Glausiusz, Josie. Toxicology: The plastics puzzle [J]. Nature,2014, 508(7496): 306-308

[10] Liao C, Liu F, Alomirah H, et al. Bisphenol s in urine from the united states and seven asian countries: occurrence and human exposures [J]. Environmental Science & Technology,2012, 46(12): 6860-6866

[11] Ike M, Chen M Y, Danzl E, et al. Biodegradation of a variety of bisphenols under aerobic and anaerobic conditions [J].Water Science & Technology A Journal of the International Association on Water Pollution Research, 2006, 53(6):153-159

[12] Danzl E, Sei K, Soda S, et al. Biodegradation of Bisphenol A,Bisphenol F and Bisphenol S in Seawater [J]. International Journal of Environmental Research & Public Health, 2009,6(4): 1472-1484

[13] Héliès-Toussaint C, Peyre L, Costanzo C, et al. Is bisphenol S a safe substitute for bisphenol A in terms of metabolic function? An in vitro study[J]. Toxicology & Applied Pharmacology, 2014, 280(2): 224-235

[14] Skledar D G, Schmidt J, Fic A, et al. Influence of metabolism on endocrine activities of bisphenol S [J]. Chemosphere,2016, 157: 152

[15] Ullah H, Jahan S, Ain QU, et al. Effect of bisphenol S exposure on male reproductive system of rats: A histological and biochemical study [J]. Chemosphere, 2016, 152: 383-391

[16] Corsi A K, Wightman B, Chalfie M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans [J].Genetics, 2015, 200(2): 387-407

[17] Rosenfeldt E J, Linden K G. Degradation of endocrine disrupting chemicals bisphenol A, ethinyl estradiol, and estradiol during UV photolysis and advanced oxidation processes [J]. Environmental Science & Technology, 2004,38(20): 5476-5483

[18] Chen Y, Shu L, Qiu Z, et al. Exposure to the BPA-Substitute Bisphenol S Causes Unique Alterations of Germline Function[J]. Plos Genetics, 2016, 12(7): e1006223

[19] Baudry M, Bi X, Aguirre C. Progesterone-estrogen interactions in synaptic plasticity and neuroprotection [J].Neuroscience, 2013, 239: 280-294