简莹娜,张学勇,李秀萍,王光华,蔡其刚,王戈平,马利青

(1.青海大学畜牧兽医科学院 省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室,青海 西宁 810016;2.青海省畜牧兽医科学院,青海 西宁 810016)

鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,M.gallisepticum)是引起鸡呼吸困难、气囊炎等症状的慢性呼吸道疾病的病原体,鸡毒支原体感染又称为慢性呼吸道病(Chronic Respiratory Disease,CRD)。M.gallisepticum感染的临床症状表现为咳嗽、流鼻涕、呼吸时发出啰音,严重时张口呼吸,在集约型的鸡养殖场中容易发生CRD;CRD在世界各地均有发生,该病通过水平和垂直方式传播,且极易在鸡场中隐性存在蔓延。据统计,M.gallisepticum的鸡群血清学调查感染率50%以上[1-2],感染此病后,鸡群的产蛋率下降、体重减轻、出栏周期延长,且饲料转化率降低,不仅增加额外药费开支,而且引起禽产品的药物残留,所以此病是威胁养鸡业发展的重要疾病之一。脂蛋白(Lipoprotein,LP)是M.gallisepticum的重要结构蛋白之一,在M.gallisepticum与宿主间相互作用中发挥重要作用,脂蛋白在M.gallisepticum的毒力及致病性中也具有重要的生物学作用：粘附作用,致炎性反应和诱导细胞凋亡[3]。本文对鸡场中的疑似M.gallisepticum感染的病鸡进行病原的分子生物学鉴定,并对其脂蛋白基因进行克隆及全面的生物信息学分析,为进一步研究其生物学功能及其在疫苗和药靶研究中的应用提供线索。为了更好地分析脂蛋白抗原相位变异及其基因多态性,以及脂蛋白变异在支原体致病力方面的影响和重要生物学意义提供一定数据支持。

1 材料与方法

1.1 样品采集处理 对疑似鸡毒支原体病鸡尸体进行临床症状观察,切开气道观察气管黏膜及气囊、肺脏。其次,剪取0.5 cm3大小的组织块分别放入新的Eppendorf管中,用剪刀剪碎组织,利用天根生化科技(北京)有限公司的DNA提取试剂盒提取DNA,具体操作步骤按照试剂盒使用说明书进行,DNA置于-20℃长期保存。

1.2 分子生物学鉴定 利用鸡毒支原体crmA基因[9]和lipoprotein基因[10]建立的检测方法,设计引物及实验反应程序进行PCR鉴定。PCR方法所用的引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成(见表1)。PCR扩增酶为宝生物工程(大连)有限公司的PremixTaq酶,扩增反应体系如表2。扩增后产物在1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳,再在凝胶成像仪中观察拍照。

表1 鸡毒支原体分子鉴定所用引物

表2 PCR反应液配制 (体系为50 μL)

1.3 基因测序分析 PCR阳性产物测序委托北京金唯智生物科技有限公司完成,采用Sanger双脱氧链终止法进行双向测序。测序结果经峰图分析后,再在GenBank上用BLAST(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行同源序列搜索,应用MEGA5.0软件进行比对分析。

1.4 脂蛋白(部分)特性分析 将lipoprotein基因翻译成蛋白序列,双向比对后在ExPASy(http：//www.expasy.org/)数据分析系统中,进行蛋白特性预测。采用 TargetP(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)和SignalP(http：//www.cbs.dtu.dk/ser-vices/SignalP/)程序分析LP蛋白的分泌信号肽和信号肽酶剪切位点;利用HMMTOP(http：//www.enzim.hu/hmmtop/index.php)和TMHMM-2.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/) 分析LP蛋白的跨膜区域,应用ProtScale(http：//web.expasy.org/protscale/)分析LP蛋白质的亲/疏水性。采用 SOPMA(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)软件进行LP蛋白二级结构预测;利用Predicted Antigenic Peptides(http：//imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl)进行抗原表位分析。

1.5 序列比对与系统发育树的构建 通过NCBI提供的BLAST在线搜索服务软件获取其他鸡毒支原体的LP蛋白的基因序列。使用MEGA5.0软件的系统发育树构建功能对这些基因序列进行分析,选择邻近法(Neighbor-Joining method,NJ)构建系统发育树,并使用自展值(Bootstrap)检验其可靠性,重复次数为2 000,分析不同分离株鸡毒支原体lipoprotein基因间的进化关系。

2 结果

2.1 分子生物学鉴定 使用基因组DNA提取试剂盒提取DNA后,基于crmA基因进行PCR扩增,扩增出288 bp的目的片段(如图1);同时基于lipoprotein基因再次进行PCR扩增鉴定,扩增出726 bp的目的片段(如图2),将PCR产物进行测序,所得序列在GenBank用BLAST进行同源序列搜索并上传至GenBank,均与M.gallisepticum S6株全基因组比对(CP006916)同源性均在95%以上。

图1 CrmA基因扩增结果

图2 lipoprotein基因扩增结果

2.2 脂蛋白基本性质分析 经过ExpASy在线系统分析,此段LP蛋白长度214个氨基酸,分子量大小为23.74 kDa,等电点(pI)为4.99;带正(Arg+Lys)负(Asp+Glu)电荷氨基酸残基数为20和24。LP蛋白在280 nm处的摩尔消光系数为20 400 mol-1·cm-1及0.1%浓度(1 g/L)的Abs值为0.859;LP在溶液中的不稳定指数为15.88(阈值＜40),推测LP为稳定蛋白;LP的脂肪族指数为59.72,亲水性平均系数(GRAVY)为-0.703,蛋白总体亲水性较低。此段LP蛋白序列信号肽预测cutoff值为0.450(＜0.9),此段蛋白无信号肽和信号肽酶剪切位点。预测可见,LP蛋白为非跨膜蛋白,为膜外蛋白且是疏水蛋白;LP蛋白二级结构预测分析发现α螺旋比例为37.85%,β转角比例为9.81%,无规则卷曲比例为39.72%,延伸链比例为12.62%,可见LP蛋白的二级结构以无规则卷曲为主(如图3)。对LP蛋白的氨基酸序列中潜在的抗原表位做进一步分析,显示有5个潜在的抗原表位,且平均抗原倾向性系数为0.9870,LP蛋白含有较多的优势抗原表位结构,可作为一种免疫原性蛋白。

图3 脂蛋白预测三维构象图

2.3 系统发育树的构建 通过MAGE5.0软件构建的NJ树如图4所示,其中本研究克隆序列(Gen-Bank登录号KY088057)与美国分离株AY556082聚在一支,可见在系统发育树上发现二者之间的进化距离最近。这为后续从分子遗传学角度探索lipoprotein基因功能提供研究思路。

3 讨论

图4 不同分离株鸡毒支原体lipoprotein基因的系统发育分析

本试验鉴定的M.gallisepticum,分离自养殖场的疑似鸡毒支原体病例,采用PCR方法利用crmA基因和lipoprotein基因进行分子鉴定,都获得了预期片段大小,通过对相应样品进行测序,进一步确认为M.gallisepticum。由于M.gallisepticum引起的慢性呼吸道病为接触性传染病很难净化,可以在鸡场中长期蔓延,且易复发,加上与其他疾病如大肠杆菌病和传染性支气管炎等并发或继发感染[7]。特别是在集约化程度较高、管理不善、环境不佳、气温骤变等因素都会促进M.gallisepticum隐性感染的鸡群发病或引起M.gallisepticum的感染[6-7]。M.gallisepticum单独感染多呈现亚临床感染症状,死亡率较低,基本在10%以下,与其他病原混合感染或继发感染时,M.gallisepticum感染加重,死亡率会提高至30%以上[8-9]。在我国的广东省、广西省、山东省的鸡场都曾发生呼吸道疾病,且鉴定分离到M.gallisepticum[10-12],同时在西藏和青海地区自然养殖与集约化养殖的鸡群中也广泛流行着由M.gallisepticum感染引起的呼吸道疾病[13-14]。可见,M.gallisepticum感染已成为威胁养鸡业的隐形病原。

新型有效的疫苗是预防M.gallisepticum感染的有效手段,但是其表面抗原具有不断改变的能力,且通过抗原变异性来逃避宿主的免疫抵抗[5],因此对重要结构蛋白之一的脂蛋白基因进行克隆分析,该蛋白总体亲水性较低,为疏水性蛋白,二级结构包括α螺旋、β转角、无规则卷曲和延伸链。同时发现,脂蛋白有5个潜在的优势抗原表位,可作为一种免疫原性蛋白。这些分析为该蛋白功能的进一步研究提供了数据支撑。

M.gallisepticum作为引起鸡慢性呼吸道病的主要病原之一,可能在本地区长期存在蔓延感染,造成养鸡业巨大的经济损失。因此,对本地区分离株病原进行分子鉴定研究,对诊断预防该病的发生都具有重要的现实意义;借此提示控制此病的发生流行,坚持疫苗和药物预防,加强饲料营养管理,注重禽舍内通风空气交换,控制疾病水平传播,注意处理种蛋的垂直传播,净化鸡群,积极防治M.gallisepticum感染的发生。