高玉龙，宋中邦，李梅云，李文正，王丙武，李永平

(云南省烟草农业科学研究院，烟草行业烟草生物技术育种重点实验室，国家烟草基因工程研究中心，昆明650021)

植物NHX(Na+,K+/H+exchanger)是植物细胞重要的跨膜离子转运蛋白，在建立和维持细胞内离子及pH梯度中发挥重要的功能[1]。NHX反向转运蛋白主要负责单价阳离子/H+逆向转运，有助于细胞内Na+和K+的动态平衡[2]。NHX蛋白将一价阳离子Na+或K+从胞质转移到液泡中，同时将H+转运到细胞质，这个过程还需要H+移位酶、H+-ATPase和H+-PPiase参与[3]。

NHXs普遍存在于所有真核生物中，在植物抵抗非生物和生物胁迫中起着重要作用，如提高耐盐[4-5]、耐冷[6]、抗干旱[7]及抗病性[8]等能力。NHX耐盐性研究最为广泛，过表达拟南芥AtNHX1基因[5]、绿豆VrNHX1基因[9]、小麦TaNHX2基因[4]，均可提高转基因植株的耐盐性。NHX基因过表达可以在液泡中分配更多的Na+被认为是NHX蛋白增加植物耐盐性的生理机制[10]。在番茄中过表达AtNHX1可以显著提高番茄钾离子含量及耐盐性[11]，在落花生[12]、柳枝稷[13]、菊花[14]中也获得同样的结果。

烟草是中国重要的经济作物，烟叶品质是决定烟叶价格的重要因素。钾被认为是烟草的品质元素，钾含量是评价烟叶品质优劣的重要指标之一。烟叶钾含量提高可以改善烟叶的组织结构，使烟叶结构细腻，而且还能提高烟叶外观色泽，使烟叶呈深橘黄色，香气足，吃味好，富有弹性和韧性，填充性增强。钾还可以增强烟叶糖类、色素类、芳香类物质的合成积累。另外，中国土壤盐渍化日益加重，培育耐盐渍化烟草品种可以增加烟草种植面积。所以克隆烟草NHX1基因并研究其生理功能对烟叶生产意义重大。

1 材料和方法

1.1 试验材料及处理

本研究所用材料为‘云烟87’。开花期取根、茎、叶、花后液氮速冻并于-80 ℃保存，用于qRT-PCR分析NtNHX1-3的组织特异性表达情况。温室种植‘云烟87’，按每株5 g纯氮施入烟草专用复合肥(氮∶磷∶钾=10∶10∶15)，分5次施入。打顶后0、8、24、48、72 和96 h取中部叶片(第9叶位)液氮速冻，于-80 ℃保存并用于qRT-PCR分析NtNHX1-3在打顶后的表达变化。对5～6片叶的‘云烟87’烟苗进行盐胁迫处理，在小花盆中每株施用100 mmol/L NaCl 500 mL，处理后0、1、3、6、12和24 h取叶片液氮速冻并保存于-80 ℃，用于qRT-PCR分析NtNHX1-3基因在盐胁迫后的表达情况。

1.2 方 法

1.2.1总RNA提取及cDNA合成按照试剂盒RNAiso Plus(Takara)的操作说明，提取各材料的总RNA。由微量紫外检测仪Nano-Drop检测RNA浓度。利用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time，TaKaRa)将提取的RNA反转录成cDNA。

1.2.2基因克隆拟南芥AtNHX1(NP_198067)蛋白提交NCBI烟草数据库，利用Tblastn程序进行搜索，获得烟草NHX1基因同源序列。根据获得的烟草同源序列，设计扩增全长CDS序列引物F(ATGGCTTTCGACATTGGGATG)和R(TTAATGATCACTTGGTTCAGT)。以‘云烟87’叶片cDNA为模板克隆目的基因，反应在Mastercycler®pro扩增仪上进行，反应总体积50 μL，包括200 ng cDNA，5×Phusion HF反应缓冲液10 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，2U的Phusion®High-Fidelity DNA Polymerase，10 μmol/L正反向引物各1 μL，补水至50 μL。扩增程序为：98 ℃ 30 s；98 ℃ 7 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃延伸7 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶分离后回收测序。

1.2.3生物信息学分析利用在线工具ExPASy (http://web.expasy.org/compute_pi/)分析推测的蛋白理论等电点、分子量等。wolf pSORT (http://www.genscript.com/wolf-psort.html)预测亚细胞定位。TMpred(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)分析跨膜区。SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/ cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)软件预测蛋白的二级结构。ClustalX软件对蛋白质序列进行多序列比对，然后用软件MEGA6构建进化树。

1.2.4qRT-PCR分析根据克隆的基因序列设计qRT-PCR引物PN3-QF(GGTCGGTCATTTGTTGGAGG)和PN3-QR(CGAGAGTTCTTCCCACCACT)。以烟草Actin基因作为内参，引物为Actin-F(CTGAGGTCCTTTTCCAACCA)和Actin-R(TACCCGGGAACATGGTAGAG)。以cDNA为模板进行荧光定量PCR，反应在Roche LightCycler 480上利用LightCycler 480 SYBR Green I master进行，20 μL体系含有 10 μL LightCycler 480 SYBR Green I master(2×)，正反引物各1 μL(10 μmol/L)，cDNA 1 μL(反转录产物稀释4倍)，7 μL 灭菌蒸馏水。反应程序如下：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性20 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，45个循环。荧光定量PCR结果采用2-ΔΔCt方法计算NtNHX1-3基因的相对表达量。每个处理设3个生物学重复，由Excel软件绘制柱状图。

2 结果与分析

2.1NtNHX1-3基因克隆为了克隆烟草NHX1基因，将拟南芥AtNHX1(NP_198067)蛋白提交NCBI烟草测序数据库进行BLAST搜索，获得2条烟草NHX1同源序列，其中一条NtNHX1-1本课题组已发表[15]，另一条命名为NtNHX1-3。依此序列设计扩增全长CDS引物(F: ATGGCTTTCGACATTGGGATG；R: TTAATGATCACTTGGTTCAGT)，通过PCR扩增获得1 617 bp的片段(图1)。回收并测序，结果与NCBI数据库中的序列100%一致，其编码蛋白质长度为538 aa。序列分析表明，NtNHX1-3编码蛋白含有NHX类蛋白保守位点，即氨氯吡嗪咪结合位点 (LFFIYLLPPI) (图2)，该位点被认为是结合和转运Na+的区域。多序列比对显示， NtNHX1-3蛋白序列与拟南芥NtNHX1相似性为85%(图2)。

M. DL2000图1 NtNHX1-3 的PCR扩增Fig.1 PCR amplification of NtNHX1-3

图3 NtNHX1-3蛋白跨膜区预测Fig.3 Transmembrane region prediction of NtNHX1-3

2.2 生物信息学分析

利用在线工具ExPASy预测NtNHX1-3蛋白的理论等电点为8.67，分子量为59.34 kD。wolf pSORT预测NtNHX1-3属于膜蛋白，TMpred分析NtNHX1-3具有11个跨膜区(图3)。二级结构预测NtNHX1-3 含有45.54%的α螺旋，19.33%的β折叠，29.18%的无规则卷曲，5.95%的β转角。

NtNHX1-3与拟南芥、棉花、鹰嘴豆、番茄、小麦、菊苣、野菊花等NHX蛋白序列构建进化树(图4)，烟草NtNHX1-3与菊苣、野菊花NHX遗传距离最近，而与同是茄科的番茄NHX遗传距离较远，可见NtNHX1-3在物种间变异较大，进化速度较快。

2.3 NtNHX1-3 基因组织表达特性分析

qRT-PCR对NtNHX1-3基因在烟草开花期根、茎、叶、花中的表达情况进行了分析，结果表明(图5)，该基因在叶片中表达量最高，根、茎、花中也有表达。表明该基因组织特异性特点不明显，可能在各个组织中都发挥功能。

图4 NtNHX1-3蛋白与其他物种NHX1 蛋白序列的进化树Fig.4 Phylogenetic tree analysis of NtNHX1-3 and NHX1 from other plants

图5 NtNHX1-3组织特异性表达分析Fig.5 Tissue-specific expression analysis of NtNHX1-3

方框所示为氨氯吡嗪咪结合位点图2 烟草NtNHX1-3蛋白序列与拟南芥AtNHX1多序列比对 Box indicated amiloride binding-siteFig.2 Sequence alignment of the deduced amino acid of NtNHX1-3 and AtNHX1

2.4 NtNHX1-3基因在盐胁迫条件下的表达分析

文献报道NHX1基因在植物耐盐胁迫中起着重要作用。为了初步研究NtNHX1-3基因是否在盐胁迫中发挥功能，利用100 mmol/L NaCl处理烟苗，处理后不同时间点取样分析NtNHX1-3基因的表达变化。结果表明(图6)，NaCl处理后3 hNtNHX1-3基因的表达开始提高，6 h达到最高峰，12 h和24 h下降到处理前水平。推测NtNHX1-3基因在烟草抵御盐胁迫的初期发挥功能。

2.5 打顶后NtNHX1-3基因表达特性

打顶后烟草叶片钾含量总体呈下降趋势[16]，但也有研究报道钾含量呈先上升后下降的趋势[17]。作者研究表明烤烟推广品种‘云烟87’及‘K326’叶片钾含量在打顶后先上升，到20 d左右达最高值，然后急剧下降到低于打顶前的水平。该研究对打顶后0～96 h内NtNHX1-3基因的表达进行了分析，该基因的表达在打顶后呈逐渐上调的趋势(图7)。该基因负责钾离子从细胞质向液泡的转运，打顶初期NtNHX1-3基因表达上调，增加了钾离子向液泡的转运和储存，从而使叶片钾离子含量升高。

图6 NtNHX1-3盐胁迫处理后的表达分析Fig.6 Expression of NtNHX1-3 after treatment by NaCl

图7 NtNHX1-3打顶后表达分析Fig.7 Expression of NtNHX1-3 after topping

3 讨 论

植物NHXs属于单价阳离子/H+转运体家族，而且普遍存在于所有真核生物中。在拟南芥基因组中鉴定了8个NHX蛋白，根据亚细胞分布分为3类：AtNHX1-4为液泡NHX，NHX5-6为内膜NHX，NHX7-8为质膜NHX[2,18-20]。NHX1属于液泡膜Na+,K+/H+反向转运体，定位于液泡膜，主要负责将Na+和K+从细胞质泵入液泡，同时将H+从液泡泵入细胞质以维持离子电荷平衡[11,21]。

NHX1在植物抵抗盐胁迫反应中发挥重要功能。NHX1的耐盐性首先是在过表达拟南芥AtNHX1后发现的，过表达AtNHX1植株细胞内过多的Na+可以被转移到液泡内，从而使细胞质Na+可以维持在一个适宜的含量水平。随后过表达NHX1的相关研究[22-24]及耐盐植物品种中NHX1基因的表达分析[25-26]证实了NHX1转运体在耐盐中的重要功能。除了增强耐盐性，NHX1在植物生长发育过程中维持K+平衡方面也发挥重要功能。由于K+是许多酶的辅助因子，所以NHX1对植物的正常发育是必须的。拟南芥nhx1突变体细胞变小、植株变矮，nhx2突变体没有明显的表型变化，但是双突变植株nhx1nhx2细胞延伸、生长抑制效果相比nhx1更为显著，表明NHX1和NHX2间存在功能冗余和互补。双突变植株nhx1nhx2由于液泡钾离子含量减少，其叶片钾离子只有野生型的1/3[27]。

本课题组先前已报道了1个烟草NtNHX1-1基因[15]，NtNHX1-1受NaCl处理诱导表达，表明NtNHX1-1在烟草耐盐方面发挥一定功能。本研究克隆了烟草的另1个NHX1基因NtNHX1-3。NaCl处理后早期NtNHX1-1的表达上升，推测其也参与了烟草的耐盐胁迫。另外，在烟草打顶初期该基因的表达逐渐上升，而烟草钾含量在这个时期也呈上升趋势，可能是由于NtNHX1-3基因表达提高后增加了液泡钾离子含量，从而提高了细胞及叶片的钾含量。后续将对烟草NtNHX1-3基因在耐盐性及提高钾含量方面的功能进行转基因鉴定。