韩晓雨 张景翔 阎澜

(1.海军军医大学学员二大队学员五队，上海 200433；2.海军军医大学药学院军特药研究中心，上海 200433)

近年来随着大量抗生素、糖皮质激素、免疫抑制剂的应用，以及器官移植术的开展，真菌感染日渐增多，尤其是需要重症监护的患者[1]。而在所有的真菌感染中，又以白念珠菌最多见。脓毒性念珠菌感染患者的死亡率超过30%[2]。真菌感染是重症监护人群中高发病率，高死亡率的最常见原因之一。侵袭性念珠菌病 (invasive candidiasis，IC)是实体器官移植受者 (organ transporter，OTR)死亡的常见原因，其中最常见的物种是白念珠菌 (46.3%)[3]。随着真菌对经典抗真菌药物耐药性的日渐增加，寻找新的抗真菌药物靶点刻不容缓。白念珠菌液泡对菌丝生长和致病力至关重要，因此，研究真菌液泡功能及其发挥作用的机制有助于寻找抗真菌化合物新靶点及筛选新的化合物。

液泡是真菌细胞中类似哺乳动物细胞中溶酶体的一种细胞器，为一种较大的酸化细胞器，具有降解大分子、储存营养物质、耐受外界压力，维持钙和金属离子的稳态[4]，内吞和分泌途径中的膜运输等功能[5]。真菌液泡是一种高度动态的细胞器，白念珠菌由无毒力的酵母相转变为有毒力的菌丝相时也要经历液泡的动态变化。液泡主要通过促进菌丝生长及提高白念珠菌对应激的反应能力两方面来帮助白念珠菌发挥其毒力[6-7]。在液泡生物发生中具有严重缺陷的突变菌株是无侵袭力的。通过抑制液泡膜质子转运ATP酶 (Vacuolar-type H+-ATPase，V-ATPase)功能和通过V-ATP酶抑制剂酸化酵母液泡，也可以降低白念珠菌的毒力。白念珠菌的菌丝在宿主的定植和侵袭期间起着重要作用，而菌丝的生长又受到液泡的调节，因此通过抑制液泡的功能来降低白念珠菌的侵袭力是理想的抗真菌策略。现对白念珠菌液泡重要功能蛋白研究进展作一综述。

1 V-ATPase

液泡功能取决于液泡V-ATPase维持酸性pH值[8]。V-ATPase存在于液泡膜，由V0、V1亚基组成，通过将H+从细胞质主动转运入液泡内从而维持液泡内酸化，对蛋白质加工和降解，内吞运输，pH驱动的胞吐作用，代谢物、离子和毒性药物的运输和隔离等发挥重要作用[9]，也是白念珠菌维持侵袭力所必需的蛋白之一。V-ATPase活性受损会削弱白念珠菌侵袭感染过程中许多因素：如毒力因子 (利于菌丝侵入的酶)的分泌，菌丝向宿主细胞的侵入，生物被膜形成，抵抗宿主固有免疫力和产生对抗真菌药物的耐受性。VMA基因缺失菌缺乏V-ATPase活性，不能正常酸化内膜腔，在分泌，内体和液泡途径中均表现出缺陷，在小鼠体内无毒力[2]。

其结构由跨膜的V0和细胞质内的V1两个亚单位组成，前者为H+提供通道，后者能分解ATP，为逆浓度梯度转运H+提供能量。V0和V1只有在聚合时，V-ATPase全酶才有功能。Voa亚基是唯一由两种同种型VPH1和STV1编码的真菌V-ATPase亚基，分别定位于高尔基体和分泌途径，或定位于液泡膜。V-ATPase利用ATP水解将质子从细胞质驱动到液泡腔，酸化液泡并调节酵母细胞中的几种关键细胞反应系统。在tetRVMA3菌株中抑制VMA3可阻止V-ATPase在液泡膜上组装，使ATP酶特异性活性和质子转运减少90%以上，并使康纳霉素 (concanamycin)敏感性降低[10]。由V-ATPase产生的pH梯度是分泌途径中许多毒力相关蛋白质 (例如天冬氨酰蛋白酶，脂肪酶，黏附和侵袭素)分泌所必需的，这有助于白念珠菌对宿主细胞的侵袭和定植[11]。此外，自噬过程需要酸性细胞腔环境来刺激负责各种降解的酶，故也需要V-ATPase。除了细胞内pH，环境pH对白念珠菌形态转变也有很大影响[12]。到2009年，已经描述了8种类型的V-ATPase抑制剂[13]。抗V-ATPase药物临床使用可以避免使用唑类物质产生多重耐药性的问题。

2 液泡酸化

液泡酸化不仅对白念珠菌形成菌丝和建立感染的能力具有重要作用[2]，而且对于从蛋白质分选和降解到整体离子稳态的各种其他过程也是非常重要的[9]。微生物致病过程的关键是对pH的反应。在致病性酵母如白念珠菌中，pH与真菌细胞增殖，芽殖和菌丝形态之间的二态转换以及毒力有关[14]。酿酒酵母中V-ATPase功能的丧失导致1组生长缺陷，统称为vma表型。vma表型的特征是不能在碱性 (pH 7.5至8.5)、含有高浓度钙、或含有不可发酵的碳源作为唯一碳源的培养基上生长，而在酸性介质上生长 (pH 4.0到5.0)类似于野生型。因此，V-ATPase功能的阻遏会干扰各种关键细胞过程和可能对真菌毒力很重要的应激反应。VMA3编码V0C亚基，白念珠菌VMA3是液泡酸化、V-ATP酶组装和功能，以及菌丝形成所必需的[10,15]，并有助于蛋白酶、脂肪酶分泌和丝状化。VMA3的缺失抑制了丝状化并导致异常的液泡形态。VMA3的丢失比V0a同种型VPH1的丧失更严重的抑制丝状化[10]。Johnson等[16]证实了Stv1p和Vph1p在白念珠菌中具有重叠功能及V-ATPase的重要性。VPH1是白念珠菌中毒力所必需的，Vph1的破坏可导致天冬氨酰蛋白酶和脂肪酶的活性降低，以及丝状缺陷，Stv1p与黏附相关蛋白的分泌有关。VMA7缺失菌株的pH耐受性丧失，钙稳态、细胞壁应力和呼吸缺陷[17]。胺碘酮通过碱化液泡发挥其抗真菌作用，并且在相同浓度下，也抑制白念珠菌中菌丝的形成[18]。VMA5负责编码V1C基，VMA5的破坏导致生长抑制，液泡功能障碍，钙稳态紊乱和钙相关的氧化应激反应的抑制。其缺失导致自噬完成和菌丝发育的缺陷，并导致减弱的白念珠菌毒力[19]。VMA2负责编码V1B亚基，VMA2表达的抑制导致氧化反应，温度反应和应激反应的耐受性差[8,20]，导致不能在碱性pH下生长，并且改变对钙，低温，抗真菌药物和对不可发酵碳源的生长的抗性。此外，V-ATP酶不能在液泡膜上完全组装，并且质子转运和ATP酶特异性活性受损。除异常液泡形态和生物发生外，VMA2抑制导致液泡碱化，毒力相关性状，包括降解酶的细丝和分泌过程被显着抑制[20]。哺乳动物中不存在V0c'亚基的同源蛋白。因此，这种真菌特异性亚基具有很大的潜力，使其成为抗真菌药物发现的理想靶标[10]。

Vma7p与PI 3激酶Vps34p物理相互作用，PI 3激酶Vps34p是液泡蛋白转运的关键酶[21]。研究表明vma7缺失菌和vps34缺失菌在空泡酸化和金属离子的解毒作用方面具有相同的缺陷，提示液泡蛋白转运功能与液泡质子转运和液泡酸化有关[17]。

3 液泡相关基因和蛋白

3.1 Tfp1

Tfp1Δ/Δ突变菌在菌丝诱导培养基中显示出明显受损的丝状发育，并且在系统性念珠菌病的小鼠模型中是无致病力的。V1亚基Tfp1对于液泡功能和白念珠菌的发病机制至关重要，并且为抗真菌药物提供了有希望的候选物[22]。

3.2 Mlt1

Mlt1是白念珠菌中的第1个被鉴定的液泡ABC转运蛋白 (ATP-binding cassette protein)，位于液泡膜中，可以在体外将NBD-PC转运到液泡腔中，其破坏导致脂质均匀性改变[23]。Mlt1缺失不仅导致液泡腔中NBDPC积累的完全丧失，还可导致内吞作用和毒力缺陷。Mlt1的缺失也对各种毒力相关性状产生负面影响，例如菌丝形成，分泌蛋白酶活性/分泌和对氧化应激的敏感性。ABC转运蛋白参与内吞作用是最近发现的一种新功能。白念珠菌的菌丝发育与内吞作用有关，而且菌丝发育和毒力之间存在完全相关性。Mlt1p将PC转运到液泡腔中，它影响脂质稳态，从而导致内吞作用延迟，菌丝和生物膜缺陷，药物易感性，蛋白酶活性/分泌，氧化应激的激活，上述同时作用以达到最大减毒效果[24]。

3.3 VPS家族

白念珠菌通过Rim/Pal蛋白信号转导通路及ESCRT/液泡蛋白质分选组分对碱性pH环境作出应答，其中Vps28和Vps32相互作用。VPS28和VPS32的缺失[25]，使菌株对碱性pH敏感性升高，并降低了白念珠菌的毒力[26]。此外，有一致的证据表明，破坏pH的抗真菌药物也会阻止菌丝形成。Vps11p定位于液泡膜，白念珠菌vps11Δ/Δ菌株在液泡的生物发生和功能方面存在缺陷，如对压力的敏感性升高，蛋白水解活性降低和严重的菌丝形成缺陷，并且缺乏可识别的液泡结构[27]。Vps34p与液泡H+-ATPase Vma7p的亚基物理相互作用，Vps34p蛋白是液泡酸化和碱性pH下生长所必需的。白念珠菌的vps34缺失菌的自噬作用有缺陷[28]。

4 离子稳态

离子稳态对于细胞基因表达，形态转变，宿主入侵，应激反应，耐药性，离子信号的转导均至关重要，故对于真菌存活至关重要。离子稳态的失调迅速介导细胞死亡，形成了越来越多抗真菌活性的化合物的机制基础。在白念珠菌中，离子可参与膜电位维持，细胞体积调节，多种酶的辅因子形成，增殖和凋亡[29]。此外，研究发现离子稳态与氧化应激反应，形态发生，细胞壁完整性和侵袭性生长密切相关。Ccc1是位于液泡中的铁转运蛋白，当培养基含有足够量的铁时，它参与铁从胞质溶胶到液泡的隔离[30]。还原铁吸收系统在白念珠菌中与黏附，菌丝形成，抗真菌药物抗性，细胞壁完整性和线粒体功能相协调[31-32]。破坏离子稳态的化合物可以发挥抗真菌作用甚至逆转白念珠菌的耐药性。基于离子稳态的新机制可能为寻找真菌特异性靶标提供线索。

5 Vacuole Disrupting化学试剂 (VDA)

由于液泡的正常形态与功能对维持白念珠菌侵袭和致病力发挥重要作用，因此可以作为药物候选靶点。液泡完整性的严重破坏使白念珠菌不能定殖或侵入哺乳动物组织。破坏特定的液泡膜运输步骤也可以使白念珠菌对最广泛使用的抗真菌药物唑类敏感[33]。约50%的VDA化合物具有真菌选择性，不改变哺乳动物溶酶体的形态与结构。通过筛选发现9种唑类抗真菌药，1种他汀类药物和3种NSAIDs可以作为VDA显著改变液泡数量，大小和/或形状，这些VDA都抑制白念珠菌的菌丝形成[34-35]。9种唑类抗真菌药物，可抑制麦角甾醇的合成。麦角甾醇是一种调节膜双层流动性的脂质，且是同型空泡体腔融合所必需的。麦角甾醇生物合成突变体具有异常的液泡形态[36]。他汀类药物氟伐他汀通过抑制HMGCoA还原酶阻断甾醇生物合成，在筛选中也被鉴定为VDA，进一步支持真菌甾醇含量在维持液泡完整性中的重要性。类似的，对唑类靶酶Erg11p的抑制也导致大量液泡破坏。之前曾有报道，在抑制白念珠菌生长之前，氟康唑治疗的早期结果是发生严重的液泡破碎。很可能影响细胞脂肪酸，磷脂或鞘脂化合物的其他种类的小分子也会对液泡的形态和功能产生显着影响[37]。扰乱液泡功能的化学试剂在多个水平损害真菌致病机理，破坏宿主体内真菌活力。但并非所有观察到的液泡异常都与真菌生长受损一致。VDA不会导致液泡运输缺陷，但会影响白念珠菌菌丝生长。NSAIDs、托芬那酸和甲芬那酸导致酵母形式的液泡破碎，完全消除菌丝发育[33]。

Solasodine-3-o-d-葡聚糖苷通过破坏细胞内液泡杀灭白念珠菌。SG (Solasodine-3-o-d-Glucohexaose)使白念珠菌的细胞内液泡碱化，并引起液泡膜的超透性增加，导致细胞死亡。这些结果支持SG在抗真菌感染方面的潜在应用，并揭示了1种新的杀真菌机制[38]。

丙戊酸 (VPA)改变了液泡的完整性，有助于发挥抗真菌活性。VPA也会导致肌醇耗尽，从而干扰液泡ATP酶功能[39-40]。白念珠菌对VPA的敏感性是pH依赖性的。与液泡运输和组成相关的基因缺失菌对VPA敏感，比如参与液泡蛋白分选的缺失菌 (vps15、vps34、vps64和ypt72)，与逆转录复合物相关的基因缺失菌 (pep7和pep8)，以及液泡遗传和组成所需的基因缺失菌 (cla4、pep12、vam6、vps41和pep12)。全基因组筛选分别证明逆转录复合物和液泡ATP酶与VPA敏感性相关。VPA诱导的液泡表型不是内吞作用，而是肌动蛋白丝扰动或肌醇耗竭的结果。液泡的完整性和体内平衡取决于不同细胞过程的正常功能，包括肌动蛋白丝组织[41]，内吞作用，以及磷脂酰肌醇磷酸盐信号传导[42]。Deranieh等[40]表明VPA导致细胞耗尽肌醇，其破坏液泡磷酸肌醇，磷脂酰肌醇3,5二磷酸 (PI-3,-5P2)稳态并因此损害液泡形态。这些结果支持液泡的直接改变是VPA抗真菌活性的细胞机制。同时，真菌液泡具有独特的蛋白质，例如V0ATPase亚基，没有明显的人类同源物，可以特异性地靶向用于治疗真菌感染的药理学干预。

6 问题与展望

由VMA11编码且缺乏哺乳动物同源物的真菌特异性V-ATPase亚基c’的存在进一步支持了V-ATPase作为药物靶标的潜力，未来的研究可集中在VMA11和相关的V-ATPase组分对白念珠菌细胞生物学和毒力的贡献[10]。通过破坏液泡功能来作为减弱白念珠菌毒力的靶标，是完全可行的且极具发展潜力。如可以①通过与液泡膜的物理作用，损害脂质双层的完整性；②直接抑制负责液泡内AIR色素生物累积的ABC转运蛋白；③改变脂质组成，从而改变液泡膜的物理化学性质；④破坏液泡的膜运输途径；⑤直接阻断液泡的生物发生。未来的工作可以探索pH毒性的具体贡献。