冷 傲 刘 鹏□ 董明慧 杨向群# 刘 芳△

(第二军医大学, 1 学员旅临床一队; 2 解剖学教研室, 上海 200433)

周围神经的膜性结构包括神经外膜、神经束膜和神经内膜。其中,神经束膜包裹着神经内大小不等的神经纤维束。神经束膜又分内、外两层,外层为结缔组织,内层由多层扁平上皮样细胞构成,称神经束膜细胞。束膜细胞之间有紧密连接,每层上皮样细胞都有基膜[1]。传统观点认为神经束膜上皮仅仅对进出神经的物质起屏障作用,而事实上,神经束膜上皮样细胞不是简单的上皮细胞。从发育上说,它起源于胚胎时期中枢的神经管结构;从功能上说,它对周围神经的发生以及损伤后的再生有重要的调控作用。自20世纪80年代起,神经束膜细胞的研究取得了较大的发展。转基因技术、基因敲除技术等新的研究方法的引入使得对神经束膜细胞的研究更加深入。目前常用的标记神经束膜细胞的分子有Nkx2.2a[2]、Glut-1[3],以及一些紧密连接蛋白[4]如claudin-1、claudin-3、ZO-1、occludin等。现就神经束膜细胞的发育及其在周围神经损伤修复中的作用作一综述。

1 神经束膜细胞的发育

周围神经系统相关细胞在发育过程中,往往需要经过一个长距离的迁移才能到达目的部位。对于神经束膜细胞而言,探究其来源与迁移对研究其作用尤为重要,而神经束膜细胞自身的活动又对神经束、神经胶质细胞的发育有着重要作用。

1.1 神经束膜细胞的来源

对于哺乳动物神经束膜细胞的起源,最初有3种说法,分别源自中胚层、神经嵴和神经管。早在1989年,Bunge等[5]报道将成纤维细胞、施万细胞和背根神经节神经元共培养,可以形成神经束膜样结构,推测神经束膜细胞可能与成纤维细胞相似,起源于中胚层。但后来的研究显示这种神经束膜样结构中的细胞不表达神经束膜细胞的基因,故这一说法受到了挑战。Joseph等[6]通过标记胚胎神经嵴细胞的方法,表明小鼠神经束膜细胞并非由神经嵴细胞发育而来。2014年,Kucenas等[7]采用增强绿色荧光蛋白转基因大鼠,显示大鼠脊髓运动神经的束膜细胞中存在着一个Nkx2.2阳性的细胞亚群,反映了其中枢来源。因此,目前认可度较高的观点是运动神经的束膜细胞来源于胚胎时期的神经管。而关于神经束膜细胞来源于神经管的具体部位和具体发育时期,以及感觉神经的束膜细胞的来源等问题,则尚未见报道。

1.2 神经束膜细胞的迁移及机制

近10年来关于神经束膜细胞迁移方面的研究取得了一些进展。Kucenas等[8]应用延时成像技术研究显示斑马鱼的神经束膜细胞自脊髓迁出的过程,与施万细胞以及运动神经元轴突相同,均在1个被称作运动神经迁出点(motor axon exit points, MEPs)的位置迁出,并且神经束膜细胞的迁出要晚于施万细胞[9],目前认为主要是Notch通路参与了其中的调控。Notch通路是一个参与细胞正常形态发生等多个过程调控的信号通路[10],Edenfeld等[9]对果蝇的研究表明,Notch信号通路与介导束膜细胞迁移有关。其中,NotchB-8X或Notchts1基因的突变均可引起束膜细胞的异常迁移和细胞形态的伪足样变。Notch信号通路还参与调控脊椎动物周围神经胶质细胞的发育过程,细胞膜上的Notch受体被激活,释放出受体细胞内结构域(Notch intracellular domain, NICD), NICD转运到细胞核中,与其共因子RPB-Jκ结合,继而进一步激活后续靶基因的表达[10]。在外周神经发育的研究中,Her4和Sox10是研究较多的2个靶基因,它们在施万细胞和神经束膜细胞中均高表达,而且随着细胞迁移过程的开始而出现,随迁移过程的结束而消失[11]。

Laura等[11]通过荧光标记的方法对斑马鱼神经发育过程中施万细胞和神经束膜细胞分别进行观察研究,显示在胚胎发育72h左右,在神经嵴轴突迁出点神经束膜细胞的Nkx2.2a和施万细胞Sox10的表达丰度达到最高,96h开始减少,108h完全消失,这恰与神经束膜细胞的迁出过程相吻合;如在迁移早期24～38h 阻断Notch通路,神经束膜细胞就会在形态上发生伪足样改变而不会迁出中枢。这一研究提示Notch通路参与调控神经束膜细胞从中枢迁移到周围的过程。进一步研究表明,在神经束膜细胞迁出中枢之后,在其随施万细胞与运动神经元移动的过程中,Notch通路信号分子的表达逐渐下降,即便在此时期阻断Notch通路,也不会影响神经束膜细胞的运动方向和速度;另外,如果在迁移早期阻断Notch通路而影响了束膜细胞迁出后,再恢复Notch通路也无法逆转。这些研究结果说明Notch通路在神经束膜细胞迁出过程中的作用具有时效性。

1.3 神经束膜细胞的生长及调节

目前对于神经束膜细胞生长的影响方面的研究并不多。Yager等[12]研究显示了一些影响神经束膜细胞生长的基因,如ine-编码的神经递质转运体、eag-编码的一种钾通道蛋白、push-编码的一种包含两个锌指结构域的膜蛋白、amn-编码的一种神经肽、NF-1-神经纤维瘤病相关基因。他们在对果蝇的实验研究中显示,ine与amn基因对神经束膜生长有抑制作用。ine蛋白的作用是通过push基因和NF-1基因的表达产物来协同实现的。单纯突变ine基因对果蝇神经束膜增厚效果并不显著,而联合突变ine基因和push基因或联合突变ine和NF-1基因则会使神经束膜明显增厚; eag基因在对神经束膜生长的影响上有与ine基因相似的生物学效应,提示此2种蛋白在调节机制上的相关性。而单独的amnX8突变也会产生神经束膜的增厚效果。关于神经束膜的生长调节机制尚不明确。

1.4 神经束膜细胞的作用

自发育到成熟,神经束膜的作用主要体现在两个方面。第一,神经束膜细胞在发育过程中参与了运动神经轴突从中枢迁出与成鞘的过程。早在1986年,Bastiani等[13]对果蝇和蝗虫的神经发生过程的研究,显示运动神经元轴突通过与一种中枢来源的段边界细胞(segment boundary cell, SBC)建立联系来介导轴突迁出中枢的过程。而对于神经束膜细胞,在明确了其中枢来源之后,研究者们逐渐重视其在周围神经发生中的作用。Kucenas等[8]报道在斑马鱼的研究中,Nkx2.2a+的束膜细胞被抑制后,运动神经元的迁出与成鞘均受到了影响,并通过荧光观察到束膜细胞迁出后围绕轴突的伸缩活动;同时,Edenfeld等[9]在胚胎中阻断Nkx2.2a阳性细胞的迁移,也显示了同样的现象。这些结果与之前Bastiani等[13]的研究结果极其相似,高度提示1986年发现的SBC正是束膜细胞。但是介导过程的具体机制尚未阐明。第二,在轴突迁出与成鞘完成之后,束膜细胞自身继续发育成熟,参与形成周围神经系统的神经束膜与血-神经屏障[14]。

2 神经束膜细胞在周围神经损伤修复中的作用

2.1 神经束膜细胞交联成桥促进轴突再生

周围神经损伤修复一直是神经生物领域的研究热点,与中枢神经相比,周围神经损伤后修复再生的能力更强。周围神经损伤常见的形式有挤压伤和轴突横断2种,不同形式的损伤所诱发的修复过程也不尽相同[13]。轴突横断后,受损神经元的胞体、断端及其支配的效应器都会经历一系列形态和生理功能上的改变[8,15-18]： 神经元损伤后,细胞核基因表达发生改变,神经递质合成减少,再生相关基因表达上调,如β-微管蛋白、生长相关蛋白43、B50、转录激活因子3、一氧化氮合酶、热休克蛋白27等。轴突断端在损伤后较短时间内即发生急性轴突变性(acute axonal degeneration, AAD),从轴突横断到AAD开始的时间间隔长短则因实验对象不同或采用的轴突横断方法不同而发生改变,目前尚无定论。AAD发生于损伤部位两侧的轴突断端,轴突降解的89%±2%均发生于这一阶段,随后降解速度减慢,胞体近侧轴突断端向胞体回缩。之后,近端轴突的长度基本保持不变,直至再生开始;而远端轴突则进一步经历Wallerian变性(Wallerian degeneration, WD),轴突内部的微管和神经纤维发生分解,轴突与其表面的髓鞘发生崩解并形成许多碎片状结构。在此过程中,轴突断端处的束膜细胞内形成囊泡,在形态上与吞噬囊泡相一致[19],并与施万细胞、巨噬细胞发生相互作用,共同吞噬降解的轴突和髓鞘的裂解片段。此后,损伤部位两断端的束膜细胞发生增殖并向横断部位中央迁移,直至交联成桥[19-20],同时诱导施万细胞长入并分泌神经营养因子如神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养因子-3、神经营养因子-4/5、神经营养因子-6以及神经调节蛋白,进一步诱导近端轴突末端向外生长。若轴突损伤缺口过大或神经束膜缺如,则神经束膜无法交联成桥,轴突也将无法完成再生。

2.2 神经束膜细胞与施万细胞、巨噬细胞的相互作用

研究者们普遍认为巨噬细胞和施万细胞在周围神经修复再生中发挥着重要作用,而对神经束膜细胞的关注并不多。近些年的研究表明,神经束膜细胞在损伤修复中也同样扮演着关键的角色,并在神经损伤修复过程中的多个环节都与上述2种细胞有着密切的相互作用。

2.2.1 施万细胞帮助神经束膜细胞“感知”神经损伤 周围神经损伤后,受损神经及其周围正常神经的神经束膜细胞都会分裂增殖并向损伤部位迁移。通过延时成像技术、变异型分析等手段可以排除受损束膜细胞残骸、神经元裂解片段和巨噬细胞在这一过程中的作用。通过对斑马鱼变异型的进一步研究表明,在施万细胞缺失时,束膜细胞向损伤部位的迁移及生长会受到严重影响,故推测施万细胞或许可辅助束膜细胞“定位”, 这在神经损伤中发挥重要作用[19],但具体机制目前尚不明确。

2.2.2 神经束膜细胞、施万细胞、巨噬细胞相互协调,共同发挥吞噬作用 及时清除AAD和WD过程中产生的裂解片段对神经再生至关重要,这3种细胞常常协同发挥吞噬功能,但它们在作用时间和空间分布上存在着一定的差异。有研究认为在AAD或WD早期,首先由束膜细胞发挥吞噬作用,一段时间之后,巨噬细胞才在趋化因子的作用下到达损伤部位,行使吞噬功能[19]。也有研究表明,巨噬细胞在神经元发生碎片化之前就已到达损伤部位附近,并且无需施万细胞的介导[21]。此外,在损伤早期神经束膜细胞主要在轴突断端发挥作用,而巨噬细胞则相对集中于横断裂隙中;在损伤晚期,两种细胞的空间分布基本没有差异。对于施万细胞而言,它在时间和空间上的分布与神经束膜细胞相近。

2.2.3 神经束膜细胞通过调控施万细胞的行为促进轴突再生[22]周围神经损伤后,施万细胞首先去分化形成具有干细胞特性的前体细胞,细胞表面的EphB2受体与束膜细胞表面的Ephrin-B配体相互作用,触发下游信号转导途径,对施万细胞内转录因子Sox2进行修饰,最终导致细胞表面N-钙黏连蛋白的重新分布,使施万细胞与神经束膜细胞之间的排斥作用以及施万细胞彼此之间的黏附作用增强。神经两断端的施万细胞增殖分裂并在束膜细胞的影响下,以多条平行细胞索的形式迁移至束膜细胞桥内,并最终在中间汇合。与此同时,施万细胞通过netrin-DCC-Unc5H等机制,进一步引导轴突再生[18]。

2.2.4 调控机制 目前对于周围神经损伤修复过程中,神经束膜细胞、施万细胞和巨噬细胞相互作用的调控机制了解甚少。相关研究表明[23],在神经发育过程中,施万细胞通过表达沙漠刺猬因子(desert hedgehog, Dhh),作用于束膜细胞上的受体Patched(ptc),对束膜发育的完整性发挥着关键作用。Dhh和ptc的表达水平在神经发育成熟后下调,并始终维持在较低水平。而在神经损伤再生的过程中,Dhh表达上调;同时实验表明Dhh缺陷小鼠在神经损伤后神经纤维变性的程度更为严重。据此可以推测,Dhh在调控束膜细胞、巨噬细胞和施万细胞的相互作用中或可发挥着一定作用。

综上所述,虽然相关研究肯定了神经束膜细胞在神经损伤修复中的作用,但尚有一些问题有待解决,如神经束膜细胞与施万细胞、巨噬细胞协同发挥吞噬作用的分子机制尚不明确。另外,由于神经束膜细胞和施万细胞在生长发育中有着密切的关联,故增大了神经束膜细胞的体内研究难度。