徐志伟，石林惠，李桃红，董绉绉

作者单位： 315040宁波，宁波市医疗中心李惠利东部医院

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种气流受限不完全可逆且呈进行性发展的肺部疾病。根据WHO统计，到2020年全球 COPD的死亡率将升至第3位。COPD的发生与多种因素有关，如吸烟、职业性粉尘及化学物质（蒸汽、刺激物、烟尘）等，其中吸烟是最常见也是最危险的因素，90%的COPD患者都是吸烟者[1]。香烟接触后即使离开香烟烟雾环境，但气道慢性炎症仍进行性发展，此过程推测可能与香烟烟雾诱导 DNA损伤有关[2]。H2AX参与DNA双链断裂（DSB）的识别和修复。本研究拟通过细胞水平探讨香烟烟雾提取物（CSE）诱导人气道上皮（HBE）细胞的DNA损伤，导致基因组不稳定，从而揭示慢性气道炎症性疾病的可能发病机制。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 材料 人正常气道HBE（上海中国科学院细胞库），香烟为专供研究所用的无任何添加剂的香烟（焦油量10mg，烟气烟碱1mg），DMEM细胞培养液（美国Hyclone公司），DMSO（美国Sigma公司），IL-6放射免疫分析试剂盒（北京北方生物技术研究所）。按Nakamura等[3]方法，将2支去过滤嘴香烟于一个注射器驱动装置连续抽吸而燃着，吸入的烟雾经三通另一个出口通入50 ml无血清培养液中制成悬液。悬液用1mol/LNaOH调至pH值为7.4，经0.22 m微孔滤膜过滤备用。制备的CSE冻存于－40℃冰箱，解冻后在30 min之内用于实验。

1.2 细胞培养及CSE干预 含10%FBS的1640培养基培养HBE细胞，细胞放置于37℃含5%CO2的恒温培养箱中，隔天换液，待细胞生长融合至80%～90%时，用胰蛋白消化传代或计数后种板实验。取生长状态良好的细胞用于实验。接种细胞密度为1×106个/ml，接种于6孔板中，在细胞融合率达到70%时，弃掉培养基，加入1.0%CSE、2.0%CSE、3.0%CSE、4.0%CSE分别干预HBE细胞，同时设立对照，4h后收集细胞培养上清液，结果最少重复3次。离心，存入－80℃冰箱，统一ELISA测量IL-6表达水平。

1.3 克隆形成实验 用1.0%CSE、2.0%CSE、3.0%CSE干预HBE细胞4 h后，将生长融合至85%左右的细胞消化，制成悬液，反复吹打成单个细胞，将细胞悬液作梯度倍数稀释，以每皿200个细胞的梯度密度接种10 cm培养皿中，轻轻转动，使细胞分散均匀，置细胞培养箱中培养2～3周，隔天观察细胞克隆形成情况，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养，弃去上清液，用PBS轻轻浸洗2次，4%多聚甲酸固定细胞15 min，去除固定液，滴加Wright-Giemsa覆盖培养皿底部，室温染色2min；滴加等量磷酸盐缓冲液，轻轻晃动，使磷酸盐缓冲液、Wright-Giemsa混匀，室温静置8 min，流水缓慢洗去染色液，空气干燥；将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，计数克隆数；克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%。

1.4 ELISA检测上清液细胞因子表达水平 对照组、1.0%CSE、2.0%CSE、4.0%CSE细胞培养上清液统一 ELISA测量IL-6表达水平。

1.5 细胞免疫荧光 经1.0%CSE、2.0%CSE、4.0%CSE干预HBE细胞及对照组HBE细胞，用PBS洗涤后，4%多聚甲醛进行固定。PBS洗涤后用0.3%Triton X 100室温通透。再经PBS洗涤，5%BSA室温固定1 h。随后用鼠抗人 H2AX单克隆抗体（1∶500稀释)，4℃过夜。PBS洗涤3次，用Alexa Flour 488/594标记的羊抗鼠(1∶1 000稀释)于37℃温育1 h。洗涤后，DAPI室温染色 10 min，中性树脂封片后可于荧光显微镜下拍照观察。实验重复3次。

1.6 统计方法 采用SPSS17.0及Prism5.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，采用ANOVA检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 克隆形成实验 发现经1.0%CSE干预后 HBE细胞的克隆形成率为（58.1±11.1）%，2.0%CSE的克隆形成率为（28.4±7.2）%，3.0%CSE的克隆形成率为（10.2±4.5）%，4.0%CSE的克隆形成率为（12.8±5.3）%，各组克隆形成率差异有统计学意义（F=255.3，P＜ 0.05）。

2.2 不同浓度CSE干预细胞后IL-6表达情况 对照组IL-6表达（9.26±5.38）pg/ml，1.0%CSE组IL-6 表达（8.26±3.90）pg/ml，2.0%CSE组IL-6 表达（20.82±5.83）pg/ml，4.0%CSE组IL-6 表达（57.70±14.39）pg/ml，各组IL-6表达差异有统计学意义（F=58.66，P＜0.05）；与对照组相比，干预组上清液IL-6的表达明显升高（P＜0.05），除1.0%CSE组与对照组差异无统计学意义（P=0.216），2.0%CSE组、4.0%CSE组与对照组差异均有统计学意义（P=0.012、0.006）。

2.3 不同干预方式下HBE细胞DNA损伤表达情况 通过免疫荧光技术检测H2AX焦点的数量和大小可反应细胞DNA损伤的情况。HBE细胞经1.0%、2.0%、4.0%CSE干预4 h后，免疫荧光染色结果显示，H2AX表达阳性细胞数分别为（9.26±5.38）%、（20.82±5.83）%及（57.06±14.38）%，差异有统计学意义（F=60.14，P＜0.05），提示HBE细胞DNA损伤反应随CSE浓度增加而增加。封四彩图3。

3 讨论

吸烟是COPD主要发病危险因素[4]，部分吸烟 COPD患者在戒烟后气流受限仍进行性发展，气道中慢性炎症持续存在，并对激素表现不敏感[5]。有学者推测是机体对香烟烟雾产生免疫反应，导致气道上皮细胞产生DNA损伤，启动气道慢性炎症反应[6]。本研究通过体外实验探讨香烟烟雾诱导气道上皮细胞DNA损伤反应。

细胞克隆实验发现HBE细胞经CSE干预后细胞增殖能力明显减弱，不同浓度CSE干预HBE细胞，上清提取液行Elisa检测显示炎性因子IL-6表达水平随CSE浓度增高而增高，提示CSE对支气管上皮细胞造成炎性损伤。IL-6不仅具有促炎和免疫调节的作用，还具有炎症放大作用，参与疾病的发生发展过程以及机体的炎症反应和免疫应答。DNA双链断裂（DSBs）是由于多种内源性或外源性物质如活性氧、电离辐射及化学药物等导致，机体对此具备一定的修复能力。发生DSBs时，组蛋白H2AX的C末端139位丝氨酸发生磷酸化，与断裂位点呈相应的数量关系，因此，H2AX是目前检测DSBs的“金标准”[7]。本研究通过免疫荧光法检测发现CSE诱导HBE细胞 H2AX阳性表达，且随CSE干预浓度增高，HBE中 H2AX阳性表达数也随之增高。

通过上述实验可初步解释吸烟导致气道慢性炎症持续存在的可能机制，即CSE可能通过IL-6扩大炎症反应，诱导DNA损伤，并影响HBE细胞基因组稳定性及其增殖活力，进而导致慢性气道炎症的持续进展。