于永慧 综述 王承龙 审校

(中国中医科学院西苑医院 中国中医科学院心血管病中心，北京 100091)

越来越多的证据表明，心肌纤维化是众多心血管疾病，如冠心病、心肌梗死、风湿性心脏病、高血压等发展至后期的共同病理改变，是影响心血管疾病预后和增加心血管疾病死亡率的重要原因[1]。2013年《JAMA》发表的一篇临床研究，发现存在心肌中层纤维化的患者5年平均死亡率为26.8%，心律失常事件发生率为29.6%；而无纤维化的患者死亡率为10.6%，心律失常发生率为7.0%。多因素回归分析提示，心肌纤维化是全因死亡、心血管死亡及心源性猝死发生的独立预测因素[2]。如何防治心肌纤维化是当前世界医学研究的难点和热点。

1 心肌纤维化发生的细胞生物学基础

心肌成纤维细胞是纤维化发生的关键效应器。成纤维细胞在氧化应激、血管紧张素Ⅱ、炎症因子等因素刺激下经由转化生长因子-β(transform growth factor-β，TGF-β)/Smad、Wnt/β-catenin等经典信号通路转化为肌成纤维细胞表型。肌成纤维细胞具备发达的高尔基体和内质网，展现出活跃的蛋白分泌功能，导致以胶原蛋白为主的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)蛋白合成与mRNA表达的增加[3]。同时，由于肌成纤维细胞具备增殖、迁移等细胞行为学特征，ECM得以在坏死心肌组织中持续存在并不断向正常心肌组织渗透。可见，成纤维细胞的表型分化、增殖、迁移、分泌等细胞生物学事件的改变是导致心肌纤维化发生的核心病理环节，而其中最直接的表现是其活跃分泌功能引起的ECM大量沉积。

ECM不仅能够参与细胞内外生物信号传递，而且其大分子结构可以为细胞提供结构支撑和组织架构[4]，发挥化学桥梁和机械支撑的双重作用[5]。随着脊椎动物的进化，ECM种类、结构和功能不断扩展以适应复杂多变的外界环境[6]。特别是在修复各种条件下损伤的心肌组织中，ECM蛋白及其与成纤维细胞的交互作用是影响“细胞-ECM”稳态的关键所在，也是决定心肌重构进行性发展的重要机制。研究发现，ECM蛋白表达谱的变化可通过整合素(integrin)介导的成纤维细胞分泌功能来实现[7]。

2 整合素β1在心肌纤维化形成中的桥梁作用

2.1 整合素家族概述

整合素属于跨膜受体家族，是由α(相对分子质量12.0×104～18.5×104)和 β(相对分子质量9.0×104～11.0×104)亚单位组成的杂二聚体，在空间上形成两条长链平行并于胞外尾端汇合的倒置“U”字形结构[8]。α亚单位的膝部有一个含半胱氨酸残基的Genu序列和Calf区域，与整合素活性的调节有关；β亚单位含有多个长程域的二硫桥结构[7]。氧化应激等环境因素可以通过修饰这些氨基酸结构，使整合素由弯曲的无活性状态转变为直立的活性状态[9]。目前在哺乳动物体内已发现18种α亚单位和8种β亚单位，它们按不同的组合构成了24种整合素[10]。整合素不仅是细胞与ECM的重要物理连接介质，亦是实现ECM和胞内力学信号及化学信号交流的枢纽，发挥ECM和细胞内生物信息沟通的桥梁作用。

2.2 整合素β1在心肌纤维化组织中的表达

正常心肌组织中主要表达含β1亚单位的整合素，如α1β1、α5β1和α7β1，分别与胶原蛋白、纤维粘连蛋白、层粘连蛋白结合，作为细胞受体介导成纤维细胞和ECM间的交流。在纤维化心肌组织中，整合素表达谱发生一些变化，α1β1、α2β1、α3β1、α4β1、α5β1、α6β1以及αvβ1、αvβ5都能够被检测到[11]。其中，Ⅰ型胶原蛋白受体整合素α2β1介导的细胞黏附是维持ECM稳态最为重要的一部分[12]，整合素α7β1作为层粘连蛋白的受体对缺血应激的心肌组织有保护作用[13]。而α1β1、α3β1、α5β1、α8β1则通过不同程度地促进炎症反应和肌成纤维细胞表型转化[14]，产生对心肌纤维化病变的促进作用。

值得注意的是，整合素β1在心肌纤维化组织中的表达与导致纤维化的病理因素密切相关，如心肌梗死后心肌纤维化、压力负荷性心肌纤维化、老龄性心肌纤维化等均具有其病理生理状态相应的整合素β1表达情况。一项观察鼠类心肌梗死模型中整合素β表达的实验发现，梗死区整合素β1的表达在心肌梗死后3 d开始上升，第7天达到高峰，而后逐渐下降至基线水平[15]。在6周龄小鼠心肌中敲除表达整合素β1的基因，结果观察到严重的心肌纤维化和对压力负荷的过度反应而造成的扩张型心肌病[16]。同样，过表达无活性整合素β1的转基因小鼠也因心肌出现广泛的纤维化病变而过早死亡[17]。同时心肌纤维化也是正常心脏老化的标志，在20月龄的小鼠心脏中，整合素α1和α5表达较2月龄和12月龄小鼠增多，而整合素β1表达减少。随着年龄的增长，不仅成纤维细胞表面的整合素β1表达下调[18]，心肌细胞整合素β1的下降亦能够导致老龄性心肌纤维化的发生。可见，整合素β1的存在对于修复心肌损伤和应对压力负荷都具有至关重要的意义。

2.3 整合素β1与其相关蛋白的互作机制

2.3.1 整合素β1介导的成纤维细胞与ECM力学黏附

细胞与ECM交联是维持多细胞生物体正常生理功能的必要环节，当细胞与ECM失去交联时，就会引发名为“失巢”的程序性细胞死亡[19]。研究发现，主要有两种受体参与成纤维细胞与ECM的黏附——整合素和圆盘状受体(discoidin domain receptors，DDRs)[11]。DDRs属于受体酪氨酸激酶家族，主要介导胶原蛋白与ECM的结合，而整合素不仅可以在与DDRs不同的结合域与胶原蛋白交联[20]，还可以介导非胶原蛋白成分与成纤维细胞的黏附。

整合素的细胞外部分主要与ECM中含有“精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸”(arginine-glycine-aspartic acid，RGD)多肽结构的蛋白进行交联。RGD多肽是1984年由Pierschbacher等在纤维粘连蛋白中首次发现，是目前证明最有效的促黏附多肽，被称之为“黏附序列”[21]。在许多非胶原蛋白的ECM成分中发现了含有RGD的氨基酸序列，主要包括纤维粘连蛋白、层粘连蛋白等。整合素相对较短的细胞内部分与各种结合体蛋白，包括跨膜生长因子受体以及踝蛋白、纽带蛋白、α-辅肌动蛋白等细胞骨架蛋白结合，形成组织良好的黏着斑结构[22]，从而在空间物理结构上形成稳定的“ECM-整合素-肌动蛋白骨架”系统，发挥胞内外力学信号的双向传导功能[23]。

整合素在胞内应力纤维和ECM间介导的力学信号可以影响ECM刚硬程度、抗张强度、成纤维细胞表型。心肌组织受到损伤或应力改变后，整合素β1通过激活蛋白酪氨酸激酶-1和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)产生细胞力学反应，对成纤维细胞生长及其表型转化施加影响。敲除整合素β1或与整合素β1相关的机械敏感蛋白ITGB1BP2[24]后，细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)1/2和糖原合成酶激酶-3β 信号通路发生异常，造成心肌抗压力应激能力减弱，从而导致扩张型心肌病和心肌纤维化病变的出现。同样，由于成纤维细胞内α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)产生的细胞内应力可以经由黏着斑募集相关蛋白，如黏着斑蛋白(vinculin)、黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)[25]，从而调节整合素的胞内结构域，对其表达、活化以及与ECM的交联产生影响。

2.3.2 整合素β1的胞内外生物学信号传导功能

整合素不仅可以与ECM中含有RGD结构的蛋白结合形成ECM骨架，还能够经由交联作用调节胞外其他ECM成分的表达。研究发现，当ECM中的纤维粘连蛋白配体与整合素α4β1、α5β1和αvβ3受体结合后，负反馈调节基质金属蛋白酶(matrix metallo preteinases，MMPs)的表达和酶解。即当蛋白配体与整合素结合后MMPs表达和酶解增强，反过来增强的MMPs又会使整合素结合体分解失活，二者维持在一定的平衡范围内。

除了与RGD蛋白交联产生对胞外ECM成分的调节，整合素还可以为细胞提供有关周围环境的关键信息，影响细胞内多种信号通路的转导，从而参与细胞的增殖、迁移、分化和凋亡[26]，称为“外至内信号”(outside-in signaling)。同样，细胞胞质内的调控信号也可以经由整合素，对受体外部配体的结合域产生影响，如引起多种整合素在细胞膜的聚集，称为“内至外信号”(inside-out signaling)。可见，整合素虽然不具备酶学活性，但可以作为双向信号受体参与细胞内外生物信号的传导。TGF-β、FAK、MAPK-ERK等，都以不同形式参与到这种信号传导机制中。

2.3.2.1 TGF-β：是心肌纤维化中激活的经典信号通路之一，在成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，及其增殖、迁移、分泌过程中发挥重要作用[27]。研究发现，整合素αvβ5、αvβ3、αvβ6以及β1均可以不同程度地激活TGF-β信号通路[28]。TGF-β与其潜在连接前肽(latency associated peptide，LAP)通过TGF结合蛋白-1并入ECM中，整合素(αvβ5、αvβ3、αvβ6)可以通过与LAP结构域中的RGD结合，引起LAP构象改变，从而释放活性的TGF-β[29]。体外研究发现，经胶原凝胶培养的肌成纤维细胞可以通过不同刚度的ECM中表达的多种整合素(β1、β3、αvβ5)激活TGF-β信号通路[30]。在人心肌成纤维细胞中拮抗整合素αvβ5和αvβ3表达，会降低TGF-β的活性，从而阻断α-SMA表达为标志的肌成纤维细胞表型转化[31]。整合素α2β1还可以经由TGF-β的激活增加赖氨酰氧化酶蛋白和基因表达，从而加强胶原蛋白与弹性蛋白的黏附[32]。

2.3.2.2 FAK：是一种相对分子质量大小为12.5×104的非受体酪氨酸激酶。当ECM配体与整合素受体结合后，与整合素相连的FAK发生构象改变，并在Y397位发生自磷酸化，随之活化环中的Y576位和Y577位亦发生磷酸化，活化FAK的C-末端与桩蛋白、踝蛋白结合[33]，引发肌动蛋白聚合、肌丝组装和肌苷重链的表达，亦可以通过雷帕霉素靶蛋白复合体1、蛋白激酶B途径促进ECM蛋白合成。

2.3.2.3 整合素连接激酶(integrin linked kinase，ILK)：是一种丝苏氨酸蛋白激酶，与整合素β1的胞内区域结合，同时连接新型半胱氨酸-组氨酸富集蛋白和小细胞蛋白(parvin)等肌动蛋白成分，将ECM与胞内肌动蛋白细胞骨架融为一体。研究发现，急性心肌梗死后梗死区ILK表达上调[34]。过表达ILK的重组腺病毒转染[35]或间充质干细胞注射[36-37]能够降低梗死和纤维化面积，减少心肌细胞凋亡，保护心功能。

2.3.2.4 蛋白磷酸化酶2A和张力蛋白同源体：是一种重要的丝/苏氨酸磷酸酶，对于细胞生长、分化具有重要意义。研究表明，敲除Ⅰ型胶原蛋白的受体整合素α2β1后，蛋白磷酸化酶2A和张力蛋白同源体磷酸化状态失稳，并引起了蛋白激酶B的活化以及α-SMA表达的增加，从而造成纤维化组织中肌成纤维转化表型的出现和大量增殖[38]。

3 以整合素β1为干预靶点的心肌纤维化治疗机遇

由于ECM胶原纤维的形成往往意味着心血管疾病晚期的开始，寻求ECM恶性累积的先兆是现阶段心肌纤维化研究的主要方向和治疗靶点。在诊断方面，ECM重构的等离子体检测、纤维母细胞特异表型的标志性蛋白(ED-A纤维粘连蛋白变体)等[39]被证实可以用于心肌纤维化的早期发现。在治疗方面，传统的心肌纤维化治疗思路是拮抗肾素-血管紧张素-醛固酮系统、TGF-β、纤维母细胞生长因子等神经-内分泌途径，然而事实证明，这些治疗手段虽然可以作用于导致ECM病理重构的部分关键性细胞事件，但其疗效却存在争议。

成纤维细胞和肌成纤维细胞代表心肌重构的阴和阳，成纤维细胞的增殖和表型变化是心肌损伤后机体自适应的保护性事件。氧化应激、炎症因子、神经内分泌因子、压力应激等促进肌成纤维表型转化的化学信号和力学信号经由整合素β1介导的“细胞-ECM”连接，一方面传递着减轻炎症反应、增强组织韧性等保护心肌组织的信息，另一方面也将纤维增生、胶原合成等需求进一步放大，造成ECM病理产物的爆发式堆积。因此，除了开发针对标志性成纤维细胞亚群的特定的治疗方法，靶向转化成纤维细胞的来源，也可以针对特定功能的整合素家族进行调节，如增加保护性整合素α2β1、α7β1的表达，降低病理性整合素α1β1、α3β1、α5β1等的表达，同时拮抗促进成纤维细胞群扩张、迁移的神经生物学刺激，将有助于逆转异常的ECM重建，为心肌纤维化的治疗带来突破。

4 总结

整合素家族是维持“细胞-ECM”稳态的一种跨膜黏附分子。整合素通过“ECM-整合素-肌动蛋白骨架”系统能够实现力学信号在胞内外的双向传递，还可以作为信号受体参与细胞内外TGF-β、FAK、MAPK/ERK、ILK等生物信号的传导。随着造成心肌纤维化的病理因素的不同，整合素β1家族呈现出不同的表达谱，传递着促进纤维化和保护心肌组织的双重信息，影响着成纤维细胞的表型、增殖、迁移、分泌等多种细胞生物学事件。选择性地调节整合素β1家族表达谱、优化成纤维细胞对环境信息的处理能力，将可能是未来心肌纤维化研究的一个重要方向。在充分认清整合素β1分子结构和功能的基础上，开发针对特定β1亚种的干预手段，将为心肌纤维化的治疗带来新的机遇。

[ 参 考 文 献 ]

[1] Wong TC,Piehler K,Klock AM,et al.Myocardial fibrosis quantified by cardiovascular magnetic resonance is associated with diabetes and predicts mortality[J].Circulation,2012,126(21):A16452.

[2] Gulati A,Jabbour A,Ismail TF,et al.Association of fibrosis with mortality and sudden cardiac death in patients with nonischemic dilated cardiomyopathy[J].JAMA,2013,309(9):896.

[3] Nanthakumar CB,Hatley RJ,Lemma S,et al.Dissecting fibrosis:therapeutic insights from the small-molecule toolbox[J].Nat Rev Drug Discov,2015,14(10):693-720.

[4] Ozbek S,Balasubramanian PG,Chiquet-Ehrismann R,et al.The evolution of extracellular matrix[J].Mol Biol Cel,2010,21(24):4300-4305.

[5] Hynes RO.The extracellular matrix:not just pretty fibrils[J].Science,2009,326 (5957):1216-1219.

[6] Huxley-Jones J,Pinney JW,Archer J,et al.Back to basics—how the evolution of the extracellular matrix underpinned vertebrate evolution[J].Int J Exp Pathol,2009,90(2):95-100.

[7] Chen C,Li R,Ross RS,et al.Integrins and integrin-related proteins in cardiac fibrosis[J].J Mol Cell Cardiol,2016,93(4):162.

[8] Campbell ID,Humphries MJ.Integrin structure,activation,and interactions[J].Cold Spring Harbor Perspectives Biol,2011,3(3):594-601.

[9] Wang W,Luo BH.Structural basis of integrin transmembrane activation[J].J Cell Biochem,2010,109(3):447-452.

[10] Humphries JD,Byron A,Humphries MJ.Integrin ligands at a glance[J].J Cell Sci,2006,119(Pt 19):3901-3903.

[11] Goldsmith EC,Bradshaw AD,Zile MR,et al.Myocardial fibroblast-matrix interactions and potential therapeutic targets[J].J Mol Cell Cardiol,2014,70(9):92-99.

[12] Gershlak JR,Black LD.Beta 1 integrin binding plays a role in the constant traction force generation in response to varying stiffness for cells grown on mature cardiac extracellular matrix[J].Exp Cell Res,2015,330(2):311-324.

[13] Okada H,Lai NC,Kawaraguchi Y,et al.Integrins protect cardiomyocytes from ischemia/reperfusion injury[J].J Clin Invest,2013,123(10):4294-4308.

[14] Schroer AK,Merryman WD.Mechanobiology of myofibroblast adhesion in fibrotic cardiac disease[J].J Cell Sci,2015,128(10):1865.

[15] Sun M,Opavsky MA,Stewart DJ,et al.Temporal response and localization of integrins beta1 and beta3 in the heart after myocardial infarction:regulation by cytokines[J].Circulation,2003,107(7):1046-1052.

[16] Shai SY,Harpf AE,Babbitt CJ,et al.Cardiac myocyte-specific excision of the beta1 integrin gene results in myocardial fibrosis and cardiac failure[J].Circ Res,2002,90(4):458.

[17] Keller RS,Shai SY,Babbitt CJ,et al.Disruption of integrin function in the murine myocardium leads to perinatal lethality,fibrosis,and abnormal cardiac performance[J].Am J Pathol,2001,158(3):1079-1090.

[18] Wilson CG,Stone JW,Fowlkes V,et al.Age-dependent expression of collagen receptors and deformation of type I collagen substrates by rat cardiac fibroblasts[J].Microsc Microanal,2011,17(4):555-562.

[19] Taddei ML,Giannoni E,Fiaschi T,et al.Anoikis:an emerging hallmark in health and diseases[J].J Pathol,2012,226(2):380-393.

[20] Xu H,Bihan D,Chang F,et al.Discoidin domain receptors promote α1β1 and α2β1-integrin mediated cell adhesion to collagen by enhancing integrin activation[J].PLoS One,2012,7(12):e52209.

[21] Kurihara H,Nagamune T.Cell adhesion ability of artificial extracellular matrix proteins containing a long repetitive Arg-Gly-Asp sequence[J].J Biosci Bioeng,2005,100(1):82-87.

[22] Kanchanawong P,Shtengel G,Pasapera AM,et al.Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions[J].Nature,2010,468(7323):580-584.

[23] Baker EL,Zaman MH.The biomechanical integrin[J].J Biomech,2010,43(1):38-44.

[24] Penna C,Brancaccio M,Tullio F,et al.Overexpression of the muscle-specific protein,melusin,protects from cardiac ischemia/reperfusion injury[J].Basic Res Cardiol,2014,109(4):418.

[25] Carisey A,Tsang R,Greiner AM,et al.Vinculin regulates the recruitment and release of core focal adhesion proteins in a force-dependent manner[J].Curr Biol,2013,23(4):271-281.

[26] Ross RS,Borg TK.Integrins and the myocardium[J].Circ Res,2001,88(11):1112-1119.

[27] Dobaczewski M,Chen W,Frangogiannis NG.Transforming growth factor(TGF) -β signaling in cardiac remodeling[J].J Mol Cell Cardiol,2011,51(4):600-606.

[28] Henderson NC,Arnold TD,Katamura Y,et al.Targeting of αv integrin identifies a core molecular pathway that regulates fibrosis in several organs[J].Nat Med,2013,19(12):1617-1624.

[29] Worthington JJ,Klementowicz JE,Travis MA.TGF-β:a sleeping giant awoken by integrins[J].Trends Biochem Sci,2011,36(1):47-54.

[30] Wipff PJ,Rifkin DB,Meister JJ,et al.Myofibroblast contraction activates latent TGF- beta1 from the extracellular matrix[J].J Cell Biol,2007,179(6):1311-1123.

[31] Sarrazy V,Koehler A,Chow ML,et al.Integrins αvβ5 and αvβ3 promote latent TGF-β1 activation by human cardiac fibroblast contraction[J].Cardiovasc Res,2014,102(3):407.

[32] Gao AE,Sullivan KE,Black LD.Lysyl oxidase expression in cardiac fibroblasts is regulated by α2β1 integrin interactions with the cellular microenvironment[J].Biochem Biophys Res Commun,2016,475(1):70-75.

[33] Nader GP,Ezratty EJ,Gundersen GG.FAK,talin and PIPKIγ regulate endocytosed integrin activation to polarize focal adhesion assembly[J].Nat Cell Biol,2016,18(5):491.

[34] Sofia RR,Serra AJ,Silva JA Jr,et al.Gender-based differences in cardiac remodeling and ILK expression after myocardial infarction[J].Arq Bras Cardiol,2014,103(2):124-130.

[35] Ding L,Dong L,Chen X,et al.Increased expression of integrin-linked kinase attenuates left ventricular remodeling and improves cardiac function after myocardial infarction[J].Circulation,2009,120(9):764-773.

[36] Mao Q,Lin C,Gao J,et al.Mesenchymal stem cells overexpressing integrin- linked kinase attenuate left ventricular remodeling and improve cardiac function after myocardial infarction[J].Mol Cell Biochem,2014,397(1-2):203-214.

[37] Mu D,Zhang XL,Xie J,et al.Intracoronary transplantation of mesenchymal stem cells with overexpressed integrin-linked kinase improves cardiac function in porcine myocardial infarction[J].Sci Rep,2016,6(11):19155.

[38] Hong J,Chu M,Qian L,et al.Fibrillar type I collagen enhances the differentiation and proliferation of myofibroblasts by lowering α2β1 integrin expression in cardiac fibrosis[J].Biomed Res Int,2017,2017(11):1790808.

[39] Spinale FG,Zile MR.Integrating the myocardial matrix into heart failure recognition and management[J].Circ Res,2013,113(6):725-738.