胡海鹰 张必利 综述 郑兴 审校

(1.第二军医大学长海医院心内科，上海 200033； 2.武警江西总队，江西 南昌 330000)

自2000年人遗传性心肌病相关基因——PRKAG2基因成功定位后，人们对于该基因的功能研究不断深入，该基因的点突变可引起不同程度的临床表现，引发了人们的极大兴趣，现对该基因的研究现状做一综述。

1 PRKAG2基因概述

PRKAG2基因定位于染色体7q36，包含16个外显子，30万个碱基，编码569个氨基酸，相对分子质量约为6.3×104。它编码腺苷单磷酸激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)γ2亚基，人类心脏组织中以此亚基形式存在。AMPK是细胞能量感受器，是调节细胞合成和分解代谢信号途径中主要的组成成分。AMPK由催化亚基α、调节亚基β和γ以异源三聚体的形式存在[1]，各亚基又有多种亚型(α1/α2、β1/β2、γ1/γ2/γ3)，不同组织的AMPK由不同的亚型聚合而成，其中γ亚基正是AMPK感受细胞能量的感应器。

PRKAG2基因包含4个胱硫醚β-合成酶(CBS)基序，它们串联形成Bateman结构域，N-末端接有一延长区域。翻译成蛋白后，CBS基序对称存在，类似扁平的圆盘，理论上可产生4个配体结合位点，能结合核苷酸AMP、ADP或ATP；但其中的CBS2不能结合核苷酸，可能是因为缺乏结合腺嘌呤核苷酸的天门冬氨酸残基[2]。

当细胞能量缺乏时(AMP/ATP比值上升)，AMP结合到γ2亚基Bateman区域，诱发α亚基激酶区的一个特异性苏氨酸残基Thr172位点磷酸化，从而激活AMPK，最终开启分解代谢途径以生成ATP，并关闭需消耗ATP的合成代谢途径，以此来维持能量的动态平衡[3-4]。高浓度的ADP与AMP作用相似，激活AMPK；而ATP作用相反[5]。Willows等[6]在细胞水平的研究显示γ2的N末端区域也可通过影响Thr172去磷酸化从而调节AMPK活性。

2 PRKAG2基因突变与临床表型

2001年，Gollob等[7]报道了PRKAG2基因突变与家族性心室预激(或WPW综合征)、传导系统异常及心肌肥厚发病有关。随后相继发现多个家系存在不同的PRKAG2基因突变，并全部或部分出现上述临床表型。该基因突变主要表现为心脏功能紊乱，典型特征是：心室预激、进展性心脏传导功能障碍、心肌肥厚以及心肌细胞糖原过量沉积，被定义为PRKAG2心脏综合征，属于代谢性心肌病，少数患者可出现骨骼肌异常等心脏外病变；确诊该病有赖于基因检测。该病虽类似肥厚型心肌病；但与之不同的是，PRKAG2心脏综合征无心肌纤维化，无肌节排列紊乱。PRKAG2心脏综合征虽然罕见，但经家系分析显示呈常染色体显性遗传，故一旦发生，可累及多名家系成员。目前，国内外报道的PRKAG2基因突变至少有16种，含1种移码突变Leu351Ins和15种错义突变，分别为：Glyl00Ser、Arg302Gln、Ser333Pro、Val336Ala、His383Arg、Arg384Thr、Thr400Asn、Lys475Glu、Tyr487His、Asn488Ile、Glu506Lys、His530Arg、Arg531Gly、Arg531Gln、Ser548Pro[2,8-16]。不同的突变位点导致的临床表型轻重不一，而即使是同一突变，家族成员的临床表现也各有差别。其中Arg531Gly突变可使受累患者在儿童期即出现严重症状，而Arg384Thr和Arg531Gln突变甚至可导致患者在出生后数周内死亡，最终只能通过尸检确定致病原因，是迄今报道最严重的类型。

3 PRKAG2基因的功能研究现状

PRKAG2基因突变分布于全身，但仅心脏受累，这可能是因为人类心肌中主要表达γ2亚型[17]。该突变是如何引起糖原沉积、心室预激、心肌肥厚或心脏传导功能障碍的？人们通过在哺乳动物细胞和转基因小鼠中过表达PRKAG2基因突变得到了初步的认识，近期又有基因敲入(knock-in)小鼠和人诱导多能干细胞培养的心肌细胞水平的研究，拓展了人们对该基因的功能认识。

在转基因小鼠水平，不同位点PRKAG2基因突变得出的结论并不一致。Sidhu等[10]研究Arg302Gln突变发现AMPK活性显著减少；而Arad等[11]发现Asn488Ile突变导致AMPK活性增高；Banerjee等[12]则发现Thr400Asn心肌中AMPK活性存在双相变化，早期激活，随后降低，最后恢复到野生型水平。因此，有学者提出PRKAG2基因突变导致AMPK活性失调(抑制或活化)是PRKAG2心脏综合征的发病机制。

Burwinkel等[18]研究表明，在哺乳动物细胞CCL13中过表达α1β1γ2异源三聚体后，Arg302Gln、His383Arg、Thr400Asn、Arg531Gly突变可同时降低AMPK-γ2对AMP、ATP的亲和力，降低程度依次递增。而在人胚胎肾脏293细胞中，过表达Arg531Gly和Arg531Gln突变，虽显著降低了AMP、ATP的亲和力，完全阻断了AMP异构激活AMPK的作用，仍可增加AMPKα亚基上的Thr172位点磷酸化水平及其活性。

虽然在转基因小鼠中过表达人γ2突变确实诱导出了类似人的一些关键疾病特征，且采用相同启动子的野生型γ2小鼠作为对照进行研究，但毕竟γ2是过表达的，因此被人诟病。为消除过表达的干扰，近来，研究者建立了三株类似人Arg302Gln、Asn488Ile、Arg531Gly突变的knock-in小鼠模型[19-20]。结果显示，所有三株小鼠的肝脏或肌肉组织的AMPK基础活性增高。Asn488Ile、Arg531Gly knock-in小鼠出现了心室预激；Arg531Gly小鼠心脏糖原含量大幅增加，心脏重量也是增加的；但Asn488Ile小鼠无此表现。相比之下，Arg302Gln knock-in小鼠无明显心脏表型。其结果与之前过表达突变的研究结论有差别。

由于Arg531Gly、Arg531Gln和Arg384Thr突变诱发了该病极严重的临床表现，这引起了研究者极大兴趣，认为上述突变对AMP和ATP结合γ亚基具有最显著的影响，对它们的认识有助于诠释疾病的发展转归。研究发现，Arg531和Arg384分别位于CBS4、CBS2，但也影响AMP或ATP结合γ亚基关键位点CBS3。Cheung等[13]在Arg531Gly和Arg531Gln突变中发现，AMP结合γ亚基减少降低了AMP激活AMPK的作用，是一种功能丧失效应；但ATP结合减少可增加AMPK活性，是一种功能增益效应，且功能增益占优势，正是这种活性增加引起了大多数病症；而出现功能丧失效应可能是因为研究种属差异引起的，因在啮齿类动物的心脏中主要亚型是γ1。

鉴于在临床表现最重的Arg531Gln突变细胞水平研究中发现AMPK活性是增高的，Salt等[2,18]更倾向于支持γ2突变后引起AMPK活性升高，即功能增益效应是PRKAG2心脏综合征的发病机理。这也可以解释为什么会出现糖原沉积？AMPK可促进心肌摄取葡萄糖，其活性增加可导致葡萄糖摄取增加，这种情况在细胞并不需要葡萄糖供给时也会发生。在转基因小鼠心脏中过表达Asn488Ile突变，证实了这种推测，该模型可诱导出类似人的心室预激和心肌肥厚[21]。在第50天时，实验组的心脏糖原比对照组增加了20倍，同时伴有葡萄糖摄取增加和糖原合成增加，而乳酸产物减少，这说明糖原合成增加是由葡萄糖摄取增加所致，而非源自糖酵解。当Asn488Ile转基因突变小鼠与携带糖原合酶对葡萄糖-6-磷酸不敏感的突变knock-in小鼠杂交时，Asn488Ile突变小鼠的高糖原表型及心室预激均被逆转[22]；但心肌肥厚仍存在，说明前者是继发于糖原含量升高，而后者不是。Hinson等[23]在人诱导多能干细胞分化的心肌细胞(iPS-CMs)的研究表明，PRKAG2基因突变通过激活AKT信号通路，提高了糖原含量，最终使心肌细胞增大，与小鼠模型结论一致。而糖原沉积是葡萄糖代谢调控的结果，因转录水平富含葡萄糖代谢的关键调控因子。研究发现编码糖原合酶及其亚型的转录产物升高，且随着糖原磷酸酶、磷酸果糖激酶和葡萄糖转运蛋白的变化而改变，后者又与稳态下代谢组学和葡萄糖代谢动力学的改变相平行。研究还发现，线粒体生物合成因子如过氧化物酶体增殖物激活受体α和γ辅激活因子1α增加，与线粒体含量升高和呼吸作用增强相符。

糖原含量异常可导致心室预激。胚胎发育过程中，心房和心室随着纤维环的形成而被分隔，以确保房室腔的唯一电传导是通过房室结。在Asn488Ile转基因突变小鼠中发现[21]，这一纤维环变薄并断裂，心肌细胞内的糖原空泡破坏了胚胎发育过程中纤维环形成，引起了心房和心室之间的异常电传导。另一项研究也发现[23]，PRKAG2突变小鼠模型中纤维环发生异常形态改变，其机制可能为激活的AMPK降低了转化生长因子(TGF)-2β生成，而受TGF-2β信号通路调控的纤维环形成因此出现异常，诱发心室预激。

Kim等[22]证实，通过逆转AMPKγ2 Asn488Ile转基因小鼠的糖原沉积，可消除心室预激；但仍存在心肌肥厚，表明心肌细胞增殖不依赖于糖原沉积，有其固有的激活机制。这一作用可能是通过增加心肌细胞的胰岛素敏感性以及激活Akt-mTOR-FOXO3A路径介导的。不同于肥厚型心肌病引起的左室肥厚，PRKAG2心脏综合征引起的左室肥厚无心肌纤维化的表现，iPS-CMs模型的研究表明这可能是由于TGF-β信号通路减弱引起[23]，iPS-CMs可表达丰富的TGF-2β，AMPK参与了TGFβ-2转录后调控。此外，在Asn488Ile突变小鼠中发现雷帕霉素复合物-1的靶蛋白信号通路高度激活，正常情况下AMPK抑制这一信号通路，有研究表明，AMPK可在特定情况下通过提供氨基酸形成自噬而激活雷帕霉素复合物-1的靶蛋白。当Xu等[8]在细胞水平研究中用雷帕霉素治疗Lys475Glu突变，细胞增殖及肥大被有效逆转；而在Asn488Ile突变小鼠中并不能完全预防，说明还有其他机制参与心肌肥厚的发生。

Wolf等[24]研究Asn488Ile转基因突变小鼠发现，其体表心电图显示PR间期缩短、QRS波变宽。与心肌工作细胞比较，心脏传导系统细胞糖原含量更高，易于受到糖原沉积的影响。这也许是临床上部分患者需安装起搏器植入治疗的原因之一。一项在大鼠心室肌细胞中过表达AMPKα1突变的膜片钳研究[25]显示，钠离子通道开放状态失活速率减慢，动作电位时程延长。其机制可能是AMPK通过磷酸化作用调节邻近闰盘的心肌细胞膜离子通道的密度和功能状态来完成。研究者推断PRKAG2突变的患者也可能受此影响。而其他离子通道如钙通道是否受突变影响还未知。

此外研究[20]还发现，在高脂饲养条件下，Arg531Gly knock-in小鼠出现了肾脏功能受损伴糖原沉积，肾囊肿形成、炎症和细胞凋亡。Arg302Gln knock-in小鼠纯合子随着周龄增大表现出明显的肥胖，而杂合子此表现较弱。肥胖可能是因为生长素水平升高促进了食物摄入，而生长素是通过下丘脑的Ca2+/钙调蛋白依赖激酶途径激活AMPK进行调节的。通过Ca2+/钙调蛋白依赖激酶磷酸化Thr172激活AMPK表明存在一种即使没有能量需求也能通过升高细胞内Ca2+激活AMPK的机制[26-27]。总之，这种knock-in小鼠显示出心脏外表型。有趣的是，在研究了上述小鼠模型后人们也关注到，人携带Arg302Gln突变的杂合子，相比于未受影响的同胞，心脏表型相对轻，存在非心脏表型特征：如肥胖增加，空腹葡萄糖和糖化血红蛋白水平增高，胰岛素水平降低等。

4 PRKAG2心脏综合征的治疗

除了在传统的药物、小分子[28]、起搏器植入、射频导管消融、心脏移植等对症治疗层面的探索，近期在转基因和knock-in小鼠的研究中，Xie等[29]通过基因编辑技术如规律成簇的间隔短回文重复工具纠正His530Arg突变，其结果令人振奋：心脏扩大、糖原空泡和沉积均被逆转，而心肌肥厚和心功能恢复至正常水平。这为人们治疗显性遗传性疾病提供了一种新的手段。

5 小结和展望

目前人们的研究主要集中于PRKAG2基因突变导致AMPK活性改变的信号通路，结合当前研究热点人诱导干细胞技术诱导多能干细胞培养的心肌细胞的兴起，其结论将更接近人的病理生理。迄今PRKAG2基因突变电生理的相关研究较少，对心肌细胞离子通道的研究尚不全面。由于PRKAG2心脏综合征属于单基因遗传疾病，结合基因编辑技术，未来有可能治愈该病。

[ 参 考 文 献 ]

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