安钢力

苏州大学唐仲英血液学研究中心 江苏苏州 215123

聚合酶链反应（polymerasechain reaction PCR）技术是20世纪80年代中期发展起来的一项基因检测即一种体外核酸扩增技术。它具有许多优点：特异性、易重复、高效性等，可以在几个小时完成过去几天或者更长时间完成的实验，因此这项技术在生物医学领域具有划时代的意义。但是，传统PCR技术有它的缺点，它通过电泳对扩增反应的最终产物进行定性分析而不能对起始模板准确定量，同时也无法对扩增反应实时检测且在实验过程中易污染而出现假阳性。人们为了寻找更为灵敏、快速、简便、高特异性的方法进行了许多探索研究，直到1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出了一种新的定量试验技术—荧光定量PCR（Flurogenic Quantitative Polymerase Chain Reaction，FQ-PCR；real-time quantitative PCR, RT-qPCR or qPCR），它是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，标记跟踪PCR产物进行实时监测反应，利用与之相适应的软件对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度，实现了PCR从定性到定量质的跨越，具有里程碑意义。目前，此项技术已应用于干细胞研究、肿瘤学和遗传疾病研究、病原体检测和传染病研究、药物分析、药物基因组学、植物学研究和农业生物科技等多领域研究中[1]。本文对实时荧光定量PCR的原理、分类和应用进行阐述。

1 实时荧光定量PCR技术的原理

real-time quantitative PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号不断累积而实现实时监测PCR全程，然后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在荧光定量PCR技术中有2个概念比较重要。（1）荧光域值（threshold）的设定：PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号标准偏差的10倍。（2）Ct值：C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数[2]。在实时荧光定量PCR中，对全程PCR扩增过程进行实时检测，根据反应时间和荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。一般来说，整条曲线可以分3个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期[3]。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号与背景无法区分，无法判断产物量的变化。在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，所以反应终产物量与起始模板量之间已经不存在线性关系，通过反应终产物也算不出起始DNA拷贝数。只有在荧光产生进入指数期，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，所以在PCR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量，由此来推断模板最初的含量而进行定量分析。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小[4,5]。通过已知起始拷贝数的标准品可得到标准曲线，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

2 实时荧光定量PCR技术荧光化学分类和定量方法

2.1 实时荧光定量PCR常用的荧光化学分类

实时荧光定量常用的荧光化学分类有SYBR Green I法和Tag Man探针法。SYBR Green I是一种具有绿色激发波长的染料，最大吸收波长约为497 nm，发射波长最大约为520 nm，可以和所有的dsDNA双螺旋小沟区域结合。因为在游离状态下SYBR Green I发出的荧光较弱，但是当它与双链DNA结合后，荧光就会大大增强，而且荧光信号的增加与PCR 产物的增加完全同步。此法的优点是它可以监测任何dsDNA序列的扩增，检测方法较为简单，成本较低，但也正是由于荧光染料能和任何dsDNA结合，如非特异性扩增产物和引物二聚体也能与染料结合而产生荧光信号，使实验产生假阳性结果，因此其特异性不如探针法[6]。因为非特异性产物和引物二聚体的变性温度要比目标产物的低，所以可以在熔解曲线（melting curve）反应过程中利用软件分析仪器收集到信号进行鉴别。

TaqMan探针法是具有高度特异性的定量PCR技术。它的工作原理是在PCR反应体系中存在一对PCR引物和一条探针，探针的5′端标记有报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团，探针只与模板特异结合，其结合位点在两条引物之间。当探针完整的时候，报告基团的荧光能量被淬灭基团吸收，所以仪器搜集不到信号，随着反应的进展，Taq酶遇到探针，利用3′→5′外切核酸酶的活性把探针切断，导致报告基团的荧光能量不能被淬灭基团吸收，产生了荧光信号，因此信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。

2.2 实时荧光定量PCR技术定量方法

在实时荧光定量PCR中模板定量有两种：绝对定量和相对定量。绝对定量指的是用已知的标准曲线来推算未知的样本的量。绝对定量的标准样品一般是指含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒、含有和待测样品相同扩增片段的cDNA，PCR的产物，把它们分别稀释为不同的浓度作为模板进行反应。横坐标为标准品拷贝数的对数值，纵坐标为得到的CT值，可做出标准曲线，根据未知样本的CT值，可在标准曲线中得到样本的拷贝数进而对未知样本进行定量。相对定量是在一定样本中靶序列相对于另一参照样本的量的变化，也就是比较经过处理的样本和未经处理的样本之间的相对基因表达差异。常用方法有标准曲线法和2－△△CT法，后者是分析基因表达相对变化的一种简便方法。

3 实时荧光定量PCR技术的应用

实时荧光定量PCR具有灵敏度高、特异性高和精确性高的优点，此项技术已被应用于分子生物学、医学、食品检测和环境监测等多个领域。

3.1 在分子生物学领域的研究应用

3.1.1 定量核酸浓度

传统方法是用琼脂糖凝胶电泳或者分光光度计测定核酸浓度，其结果不准确而且易污染，实时荧光定量PCR可以解决这些问题，它准确性、灵敏度高且无污染，对一些传染性疾病进行定量分析、病原微生物和病毒含量检测，此项技术都是首选。

3.1.2 研究基因表达

应用实时定量PCR技术可以对基因时间、空间表达水平差异进行比较。例如，对特定基因用物理、化学、药物等不同方法处理后的差异进行比较，为人们的科学研究提供依据。

3.1.3 用于单核苷酸多态性（SNP）检测分析

人们对疾病的易感性和对同一种药物治疗同一种疾病的效果是有差异性的，遗传物质DNA的多态性RELP，STR，ABO血型和SNP是个体差异的遗传基础。SNP在人类基因组中广泛存在，是人类可遗传变异中最常见的一种，在遗传性疾病的研究中具有重要意义。

3.1.4 DNA甲基化检测

DNA甲基化是表观遗传学重要的标记信息，通过实时荧光定量PCR技术获得基因组甲基化水平数据对表观遗传学的时空特异性研究具有重要意义。

3.2 在医学领域的研究应用

3.2.1 用于病原体检测

常规PCR不能定量，在操作中易污染导致出现假阳性结果，应用实时荧光定量PCR技术可以解决这些问题。目前，此项技术已应用于检测丙肝病毒、宫颈癌及其癌前病变有关的人类乳头瘤病毒、抗结核药物治疗后定量检测病人痰样本病原体DNA含量，为疾病的诊断和治疗提供依据。用此项技术还可以一次性检测大量大肠杆菌样本，简便准确，是食品检测方面的一个突破。

3.2.2 肿瘤基因检测

肿瘤发生机制非常复杂，发病机理尚未清楚，随着基因分子水平研究不断发展，肿瘤基因发生突变等遗传学改变是致癌性发生的根本原因已被广泛接受。癌基因表达异常和突变在多种肿瘤早期和良性阶段就已出现，通过实时荧光定量PCR检测可检测到基因突变，准确测定其表达量，为肿瘤早发现、早诊断、早治疗及疗效和预后的判断提供依据[7]。

3.2.3 用于药物选择和疗效判断

化疗过程中主要问题是病人对化疗药物的耐药，检测肿瘤耐药基因的表达水平是选择化疗药物的依据。检测微小残留病变的变化情况对于调整治疗策略和对病人进行个体化治疗非常重要。

3.2.4 用于优生优育诊断

唐氏综合征是由染色体异常所导致的，在产前通过实时荧光定量PCR技术做染色体核型分析，可以最大限度地防止患儿的出生，是防止此病的有效措施。此项技术还可以对孕产妇进行叶酸利用能力检测，为孕产妇提供叶酸补充具有指导意义。此项技术对于降低严重缺陷儿出生率、提高人口素质起到了积极的推动作用。

3.3 在食品检测方面的应用

食品安全是与人民群众生活息息相关的问题。食品在生产、储藏、运输、销售等一系列过程中不可避免地存在受到微生物污染的可能性，检测食品中的致病菌至关重要。

例如，对2007～2008年上半年丽水地区的生畜肉、熟肉、蔬菜等172份样本进行7个微生物项目的检测，沙门菌的检出率最高，生畜肉中的微生物污染最为严重，可以有效地提醒人们要对沙门菌污染高度重视，进而采取预防措施防控食源性疾病的发生[8]。

3.4 在环境监测方面的应用

实时荧光定量PCR技术已经被国内外应用在环境监测中，提高了监测水平。此项技术可以检测河流中环境微生物随着季节变化的情况[9]。还可以用来对地表水和饮用水中致病菌进行检测以便及时预告地表水污染情况以及采取相应有效措施避免大范围污染。水体中即使有少量沙门氏菌污染也会危害健康，此项技术可以帮助人们找到其污染源，便于及时安排沙门氏菌接种[10]。应用此技术，以炭疽芽孢杆菌特异的pagA，rpoB2cap 引物探针检测比较4种被炭疽疫苗株污染的土壤中炭疽的量，检测出底限为2.5 万拷贝/g土壤（pagA），这样可以直接从环境样品中检测炭疽菌，对炭疽防治具有重要意义[11]。

4 结语

实时荧光定量PCR技术自问世以来，由于具有定量准确、快速、特异性强、灵敏度高、操作简便等优点而受到人们的青睐。广泛应用于基础研究、医学诊断、食品检测和环境监测等领域，应用价值很高，解决了许多难题，产生了许多社会效益和经济效益。随着科学技术的不断进步，此项技术将得到更进一步的发展和完善，也必将存在更加广阔的应用空间。