夏仙仙，蔡丙杰，沙 珂，潘信心，尹光文

郑州大学第一附属医院皮肤科 郑州 450052

1 对象与方法

1.1研究对象CA标本均来自2015年9月至2016年9月郑州大学第一附属医院皮肤科门诊，患者临床表现典型，醋酸白实验为阳性，皮损经组织病理证实为CA，原位杂交证明HPV感染存在，均与CA的诊断标准相符合，且无其他系统性疾病；皮损取材前患者均未接受免疫性的药物、冷冻、激光等任何相关治疗；共收集53例CA患者组织标本，其中男32例，女21例；年龄16～65(32.5±8.7)岁；病程14～180(50.7±4.3) d。28例对照组标本均来自同期本院泌尿科成年男性包皮环切术后所切除的包皮组织，并经组织病理查证实其为正常组织上皮。

1.2试剂与方法所有实验组织标本经40 g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋，并连续作0.4 μm厚度切片，然后将其覆于用多聚赖氨酸处理过的玻片上，置于60 ℃烤箱烘烤4 h以上备用。兔抗人Bad多克隆抗体(浓缩型)购自武汉Proteintech公司，兔抗人PCNA多克隆抗体(浓缩型)购自Abcam公司，SP-9001试剂盒、DAB显色试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司。采用免疫组化SP法检测所有标本中Bad和PCNA蛋白的表达情况。所有实验操作步骤都按试剂盒上的说明进行。在相同条件，所有切片染色，且每批染色均设阳性对照、阴性对照。用已知染色阳性的组织切片为阳性对照，阴性对照以PBS代替一抗孵育组织切片。

1.3结果判断Bad蛋白阳性表达主要处于细胞膜和细胞质，阳性显色为棕黄色至棕褐色颗粒。PCNA蛋白阳性表达定位于细胞核，棕黄色或棕褐色颗粒为阳性染色。参照文献[1]评分标准，根据组织切片中染色强弱及阳性细胞所占总细胞百分比进行分级评分。染色强度分为不着色、浅黄色、棕黄色及棕褐色，分别对应着0分、1分、2分和3分；阳性细胞占总细胞的百分比≤10%：0分，11%～：1分，26%～：2分，51%～：3分，≥76%：4分；将上述两项分值的乘积作为最终结果，0分：阴性(-)，1～4分：弱阳性(+)，5～8分，阳性()，9～12分：强阳性()。

1.4统计学处理采用SPSS 17.0进行分析，应用秩和检验比较CA组织和正常包皮组织中Bad、PCNA蛋白表达的差异，应用列联系数分析CA组织中Bad和PCNA蛋白表达的关联性，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1CA组织和正常包皮组织中Bad蛋白的表达

见图1、表1。Bad阳性表达主要处于细胞膜和细胞质，阳性为棕黄色至棕褐色，大多数呈灶状或者片状并分布于棘细胞层中下部。53例CA组织中Bad蛋白阳性表达37例，其阳性表达率为69.8%，阳性表达强度多为～；28例对照组中Bad出现阳性表达有8例，其阳性表达率28.6%(8/28)，阳性表达强度多呈-～+。PCNA蛋白阳性表达主要位于细胞核，阳性显色呈棕黄色或棕褐色，位于表皮的基底细胞层、棘细胞层、甚至颗粒层，为散在性或者弥漫性分布。53例CA组织中PCNA蛋白的阳性表达46例，其阳性表达率为86.8%，阳性表达强度大多数呈～；28例对照组中PCNA蛋白的阳性表达11例，其阳性表达率39.3%(11/28)，阳性表达强度多为+～。

A：Bad蛋白；B：PCNA蛋白；1：CA组织；2：正常包皮组织图1 CA组织和正常包皮组织中Bad、PCNA蛋白的表达(SP，×400)

例

2.2CA组织中Bad和PCNA蛋白表达的关联性

见表2。列联系数分析发现Bad与PCNA在CA组织中的表达不相关(rP=0.134,P=0.325)。

表2 CA组织中Bad和PCNA蛋白表达的关联性分析 例

3 讨论

Bad是Bcl-2家族中经典的促凋亡蛋白成员之一，具有BH3同源结构域和序列，在人类正常组织细胞中均有阳性表达，乳腺、结肠、脾内以及睪丸等中出现较高水平的稳定表达[2]。生理状态下，磷酸化的Bad与14-3-3蛋白相结合，当凋亡相关信号刺激后，可诱导Bad表达水平升高或去磷酸化增强，通过易位和一些细胞活动来促进细胞发生凋亡[3]。当多种激酶作用于Bad时，可使Bad多个丝氨酸残基发生磷酸化，在某些因素下磷酸化的Bad处于无活性状态，从而使细胞减少或免于凋亡[4-5]。研究[6-7]表明，Bad在多种疾病中的阳性表达有着重要的意义。本实验结果显示，53例CA组织中有37例Bad阳性表达，而在28例正常包皮组织中只有8例Bad阳性表达，差异有统计学意义，表明CA组织中存在Bad的过表达，这种过表达提示Bad在一定程度上促进CA组织中角质形成细胞的凋亡，可能是HPV病毒感染后Bad在多种因素影响下，通过酪氨酸激酶途径激活细胞凋亡，从而一定程度上抑制CA组织细胞的异常增殖。但机体受到相关刺激或者某些激素的影响后，Bad发生磷酸化[8-11]，磷酸化Bad失去活性或者与其他成员结合形成复合物，发挥细胞抗亡的作用，间接促进CA组织细胞的过度增生。促凋亡蛋白Bad在CA组织中出现高水平的阳性表达，也提示Bad的表达过程受到其他相关因子或者激素的调控，但其具体机制不清楚，有待于进一步的研究。

PCNA为DNA聚合酶的一种辅酶，参与细胞异常增殖过程中DNA复制和细胞周期调控[12]，其表达程度和含量能够准确地反映细胞的增殖状态和生长速度情况，是细胞增殖状态的理想标记物。因此，PCNA是目前普遍公认的肿瘤细胞S期的一种标志物，已被广泛应用于细胞异常增生的实验研究。本研究结果显示，在正常上皮组织中，PCNA阳性表达率为39.3%，其阳性表达大部分在具有增殖、分化能力的基底细胞层及其附近细胞；而在CA患者组织中，PCNA阳性表达率高达86.8%，其阳性表达除在具有分化能力的基底细胞层外，分化相对良好的棘细胞层、甚至颗粒层中也出现PCNA的阳性表达，并且PCNA在CA组织中的阳性表达率和阳性表达强度均高于正常对照组，这与国内的一些研究[13]结果一致，其原因可能是HPV可以活化PCNA基因，HPV-DNA和HPV某些基因产物刺激PCNA在宿主细胞中出现过度表达，促进CA组织中表皮上层的细胞也增殖活跃，同时高表达的PCNA可以为受病毒感染的细胞复制提供所需要的大量元件，调节细胞由静止期转化为增殖期，导致HPV在棘层的上部细胞内顺利地进行DNA复制，促使细胞中染色体也进行了大量的复制，从而导致棘细胞层甚至颗粒层细胞过度的异常增殖。

本实验结果显示，在CA组织中Bad和PCNA的阳性表达无明显相关性，提示CA疾病的形成受到多种基因的调控，促凋亡蛋白Bad、PCNA及某些相关基因共同参CA的发生、发展，但其确切机制仍需进一步研究。

[1] BUCKLE MA,PAHEMIK SA,SURER A,et al.Inhibition of the alphavintegrin with a cyclin RGD peptide impairs angiogenesis,growth and metastasis of solid tumors in vivo[J].Br J Cancer,2002,86(5):788

[2] 黄娜,李为民.Bad与肿瘤关系的研究[J].华西医学,2011,26(11):1747

[3] DANIAL NN.BAD:undertaker by night,candyman by day[J].Oncogene,2008, 27(Suppl 1):S53

[4] YAMAMOTO T,KAMBE F,CAO X,et al.Parathyroid hormone activates phosphoinositide 3-kinase-Akt-Bad cascade in osteoblast-like cells[J].Bone,2007, 40(2):354

[5] LAUSSON S,CRESSENT M.Signal transduction pathways mediating the effect of adrenomedullin on osteoblast survival[J].J Cell Biochem,2011,112(12):3807

[6] 张福萍,宋祥晨,陈玉婷,等.牙龈蛋白酶诱导成骨细胞凋亡中促凋亡蛋白Bad的表达改变[J].中华老年口腔医学杂志,2013,11(5):257

[7] 李闯,钟勇,叶劲.促凋亡基因Bad在肿瘤细胞凋亡中的作用及进展[J].湖北民族学院学报,2013,30(1):70

[8] HAYAKAWA J, OHMICHI M, KURACHI H,et al. Inhibition of BAD phosphory lation either at serine 136 via AKT cascade sensitizes human ovarian cancer cell to cisplation[J].Cancer Res,2000,60(1):5988

[9] HARADA H, ANDERSEN JS, MANN M,et al.p70s6 kinase signals cell survival as well as growth,inactivating the pro-apoptotic molecule BAD[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(17):9666

[10]FUJITA N1, SATO S, TSURUO T.Phosphorylation of p27Kipl at threonine 198 by p90 ribosomal protein S6 kinase promotes its binding to 14-3-3 and cytoplasmic localization[J].J Biol Chem,2003,278(49):49254

[11]ZHOU XM, LIU Ym, PAYNE G,et al.Growth factors inactivate the cell death promoter BAD by phosphorylation of its BH3 domain on ser155[J].J Biol Chem,2000,275(32):25046

[12]ACHARYA N,KLASSEN R,JOHNSON RE,et al.PCNA binding domains in all three subunits of yeast DNA polymerase δ modulate its function in DNA replication[J].Proc Natl Acad Sci USA,2011,108(44):17927

[13]赵卫华,黄小跃,解士海,等.Livin和PCNA在尖锐湿疣组织中的表达及意义[J].皮肤性病诊疗杂志,2012,19(1):25