石晓丽，徐晓微，秦甜甜，刘卫华，张秀娟，周凯瑞，霍金玲，杨腾蛟，王 淙

郑州大学药学院 郑州 450001

食管癌是世界最常见癌症之一，主要包括鳞癌和腺癌两种，在中国以鳞癌为主要发病类型，西方发达国家主要以腺癌为主[1-2]。为了治疗这种癌症，常使用吉西他滨、5-氟尿嘧啶和紫杉醇联合化疗，长期治疗容易使患者产生耐药，降低治疗效果[3]。甾族化合物是一类重要的多环化合物，在维持人体功能、调节代谢等方面发挥着重要的作用。1994年，Fotsis等[4]发现雌激素代谢产物2-甲氧基雌二醇能够抑制血管生成而抑制肿瘤生长，这为抗癌药物的研发提供了新思路：对甾体类化合物进行结构改造和修饰，获得新型抗癌化合物。该实验旨在探讨2,6-二氰基-3-吡啶基-5-雄甾烯基苯胺(简称4d)对食管癌EC109细胞的作用，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1细胞和主要试剂化合物4d合成方法，碳谱、氢谱及质谱分析方法见参考文献[5]。4d溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，化学结构见图1。食管癌细胞株EC109、正常食管上皮细胞Het-1a由郑州大学药物研究院保存。RPMI 1640培养基及胰蛋白酶消化液(北京索莱宝公司)，标准胎牛血清(以色列BI公司)，Bcl-2、Bax、Bid抗体(美国CST公司)，Mcl-1和β-actin抗体(南京恩晶生物科技有限公司)。凋亡检测试剂盒、细胞周期检测试剂(南京凯基生物科技有限公司)。

图1 4d结构式

1.2细胞培养EC109及Het-1a细胞在RPMI 1640培养基中培养，培养基中补充体积分数10%胎牛血清。细胞在37 ℃、体积分数5%CO2加湿环境中培养，2～3 d传代1次，隔天更换RPMI 1640培养基，取对数生长期细胞用于后续实验。

1.3MTT法检测细胞增殖抑制率分别收集2种细胞，计数板计数。用RPMI 1640培养基调整每孔细胞数约3×103个，将细胞接种于96孔板中培养过夜。细胞贴壁后，分别加入0.40、0.80、1.60、3.25、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μmol/L的化合物4d作为实验组，并设置阴性对照组和空白对照组，每组设置3个复孔。48 h或72 h后，每孔加入20 μL MTT，37 ℃孵育4 h，然后小心除去培养基并向每孔加入150 μL DMSO，置于摇床10 min使其充分溶解，酶标仪测定570 nm处的吸光度(A)值。增殖抑制率=(对照孔A值-实验孔A值)/(对照孔A值-空白孔A值)×100%。实验重复3次。

1.4细胞凋亡检测将EC109细胞接种到6孔板中，加入含4d(0.0、0.5、2.0、4.0 μmol/L)的RPMI 1640培养基培养24 h后，使用不含EDTA的胰蛋白酶消化，分别收集细胞并调整细胞密度为1×106mL-1，每孔细胞重悬于500 μL Binding Buffer中，加入5 μL Annexin V和5 μL PI避光染色15 min。采用流式细胞仪在1 h内上机检测和分析结果。实验重复3次。

1.5细胞周期检测含0.0、0.5、2.0、4.0 μmol/L的4d的培养基作用EC109 细胞24 h后，分别收集细胞并用体积分数70%乙醇在4 ℃过夜固定。小心吸去固定液，用PBS洗涤固定的细胞，加入400 μL的PI和100 μL的RNase A。样品避光孵育30 min，并采用流式细胞仪进行检测。实验重复3次。

1.6细胞线粒体膜电位检测使用JC-1染料测量线粒体膜电位。1×105个EC109细胞接种于96孔板中，孵育过夜后，细胞用4d(0.0、0.5、2.0或4.0 μmol/L)处理6 h，JC-1(5 mg/L)染色20 min后使用温热的RPMI 1640培养基洗去染料。染色的细胞通过高通量筛选系统成像。根据高通量筛选系统对采集到的荧光强度进行量化统计，单体用488 nm波长激光(绿色)激发，而聚集体用561 nm波长激光(红色)激发。红色荧光代表JC-1聚合体减少，绿色荧光代表JC-1单体增加，结果用绿色与红色细胞群的荧光强度比值即JC-1单体与聚合体的比值表示。实验重复3次。

1.7Westernblot检测Bcl-2家族蛋白的表达EC109细胞用4d(0.0、0.5、2.0或4.0 μmol/L)处理24 h，收集细胞后PBS清洗2遍，加入裂解液后于冰上裂解30 min，低温离心机4 ℃离心收集上清，使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。加入6×Loading Buffer，100 ℃水浴变性10 min。通过SDS-PAGE分离蛋白质并转移至硝酸纤维素膜。用含体积分数0.5%Tween20和体积分数5%脱脂牛奶的Tris缓冲盐水(pH=7.8)在室温下封闭2 h，然后在4 ℃与一抗孵育过夜。TBST洗膜3次，在室温下温育二抗2 h。化学发光显色，暗室曝光。以阴性对照组各蛋白的相对表达量为1，采用Image J分析各蛋白的相对表达量。实验重复3次。

1.8统计学处理使用SPSS 17.0进行数据分析。4d处理不同时间后 Het-1细胞、EC109细胞增殖抑制率的比较采用析因设计的方差分析；不同组间EC109细胞凋亡率、细胞周期、线粒体膜电位及Bcl-2家族蛋白相对表达量的比较均采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 4d对Het-1细胞和EC109细胞增殖的影响结果见表1、2。可见化合物4d对食管癌细胞有明显的增殖抑制作用。

F时间=43.073，P<0.001;F浓度=358.051，P<0.001;F交互=323.054，P<0.001

表2 4d处理不同时间后EC109细胞增殖抑制率的比较(n=3) %

F时间=40.608，P<0.001;F浓度=117.980，P<0.001;F交互=109.383，P<0.001

2.2 4d对EC109细胞凋亡的影响结果见表3。由表3可知，4d处理后EC109细胞凋亡率增加。

表3 各组EC109细胞凋亡率的比较 %

F=354.940,P=0.006;*：与阴性对照组相比，P<0.05

2.3 4d对EC109细胞周期的影响结果见表4。由表4可知，4d处理后的EC109细胞出现S期阻滞。

表4 各组EC109细胞周期的比较(n=3) %

*：与阴性对照组相比，P<0.05

2.4 4d对EC109细胞线粒体膜电位和Bcl-2家族蛋白表达的影响各组EC109细胞线粒体膜电位的比较见图2及表5。Bcl-2家族蛋白的表达见图3及表6。可知，4d可降低Mcl-1的表达水平。

A：阴性对照组；B：0.5 μmol/L 4d组；C：2.0 μmol/L 4d组；D：4.0 μmol/L 4d组图2 各组EC109细胞线粒体膜电位的变化(×400)

组别n线粒体膜电位阴性对照组31．27±0．170．5μmol/L4d组32．47±0．372．0μmol/L4d组34．00±0．164．0μmol/L4d组36．20±0．45∗

F=91.136,P=0.005;*：与阴性对照组相比，P<0.05

1：阴性对照组；2：0.5 μmol/L 4d组；3：2.0 μmol/L 4d组；4：4.0 μmol/L 4d组图3 各组EC109细胞Bcl-2家族蛋白的表达

组别Mcl⁃1BaxBcl⁃20．5μmol/L4d组0．60±0．082．40±0．080．59±0．062．0μmol/L4d组0．41±0．08∗2．93±0．050．24±0．044．0μmol/L4d组0．39±0．06∗3．20±0．080．06±0．01F36．059475．704218．168P0．0040．0090．006

*：与0.5 μmol/L 4d组相比，P<0.05

3 讨论

甾体类化合物对许多癌细胞具有广谱的细胞毒性[6]。本实验结果表明，化合物4d可以有效地抑制食管癌EC109细胞的增殖，且具有浓度依赖性和时间依赖性。实验也表明4d对正常的食管上皮细胞Het-1a有一定的细胞毒性。

越来越多的研究[7]表明Bcl-2家族在细胞凋亡方面具有重要作用，这些蛋白使线粒体功能障碍，诱导细胞凋亡。Huang等[8]发现仅具有Bcl-2细胞结构域之一的Bcl-2家族的成员，是细胞凋亡的必需引发剂。一系列Bcl-2家族的抑制剂，如TW37和ABT737已进入临床试验阶段[9-10]。本实验发现化合物4d能使Bcl-2家族中Mcl-1表达下降，这与线粒体功能障碍、线粒体膜电位改变的实验结果相一致。表明4d诱导EC109细胞凋亡与启动Bcl-2家族介导的线粒体凋亡程序有关。

综上所述，化合物4d可以体外抑制食管癌EC109细胞的增殖，抑制增殖的机制与细胞阻滞和细胞凋亡相关；进一步的实验结果证实，诱导细胞凋亡的途径是Bcl-2家族介导的细胞线粒体损伤。

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