车 楠，叶 晶，姜京植，延光海，李良昌

延边大学医学院解剖学教研室 吉林延吉 133002

过敏性哮喘是一种复杂的炎症气道疾病，最常见的症状特点是气道炎症、黏液分泌过多、气道高反应[1]。辅助性T细胞2型(T-helper type 2，Th2)细胞因子介导的炎症在哮喘过程中发挥重要作用，如白细胞介素4(interleukin-4，IL-4)刺激免疫球蛋白E(IgE)的产生，参与过敏炎症和气道重塑；IL-5能够促进嗜酸性粒细胞的聚集和生长[2]。而在哮喘中Th1细胞通过分泌干扰素(interferon，IFN)抑制Th2细胞因子介导的免疫反应。因此，Th1/Th2细胞因子失平衡是哮喘发病的免疫学机制之一[3]。黑米花色苷(anthocyanin-rich extract from black rice，AEBR)属黄酮多酚类化合物，近年来研究[4-5]发现，AEBR能够通过抑制肥大细胞的活化而发挥抗过敏作用，抑制脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导RAW264.7细胞分泌肿瘤坏死因子和IL-6，在抗炎方面也具有不可忽视的作用。但AEBR对哮喘的作用还缺乏深入的研究。本实验将利用鸡卵白蛋白(ovalbumin，OVA)诱导建立小鼠哮喘模型，观察AEBR对哮喘小鼠炎症的影响，确定AEBR的抗哮喘作用及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1药品、试剂和仪器OVA、氢氧化铝粉(分析纯)(购自美国Sigma公司)，IL-4、IL-5、IFN-γ和NF-κB p65(购自美国Cell Signaling公司)，Histon和β-actin(购自美国Santa Cruz公司)， IL-4、IL-5和IFN-γ ELISA试剂盒(购自美国Invitrogen公司)，黑米花色苷(由延边大学药学院提取)；402型超声雾化器(上海四菱医疗器械厂生产)，RT-2100C酶联免疫检测仪(美国Rayto公司)，电泳仪及电泳槽、Western blot转膜仪和Gel Doc凝胶成像仪(Bio Rad公司)。

1.2哮喘模型的建立和动物分组雄性BALB/c小鼠50只，体重(18±5)g，由延边大学医学部实验动物中心提供，合格证号SCXK(吉)2003-000。采用随机数字表法将小鼠分为正常对照组、模型组、AEBR低剂量组、AEBR中剂量组、AEBR高剂量组。除正常对照组外，其余各组小鼠分别于第1、14天腹腔注射50 μg OVA+1 mg氢氧化铝和生理盐水的混合液200 μL。第21天将致敏小鼠置于玻璃罩内，每组以0.1 g OVA+10 mL生理盐水雾化激发30 min，1次/d，共5 d。AEBR低、中、高剂量组分别在激发前灌服黑米花色苷提取物50、150或300 mg/(kg·d)，共计7 d。

1.3实验样本获取与处理末次激发48 h后处死小鼠，以磷酸盐缓冲液1 mL行支气管肺泡灌洗，收集支气管肺泡灌洗液(broncho-alveolar lavage fluid，BALF)。血细胞计数仪计细胞总数。然后4 ℃、3 000g离心5 min，取上清液，-80 ℃低温保存，待测细胞因子。离心沉淀涂片后Diff-quik染色，镜下进行细胞分类计数。取右肺下叶，用体积分数10%甲醛溶液固定，石蜡包埋后切片，进行HE染色观察肺部炎症情况。其余各肺叶放入液氮中速冻，-80 ℃保存待用。

1.4细胞核蛋白的萃取参照文献[6]方法，细胞破碎后放入2倍体积的1.3 mol/L蔗糖、1.0 mmol/L MgCl2、10 mmol/L PBS缓冲液(pH=7.2)，4 ℃、1 000g离心15 min；沉淀再悬浮于2.2 mol/L蔗糖、1.0 mmol/L MgCl2、10 mmol/L PBS缓冲液(pH=7.2)中，1.0×105g离心1 h；获得的细胞核在0.25 mol/L蔗糖、0.5 mmol/L MgCl2的20 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH=7.2)中清洗，然后1 000g离心10 min；所得沉淀在含有0.3 mol/L蔗糖、50 mmol/L Tris-HCl(pH=7.2)、150 mmol/L NaCl、2 mmol/L EDTA、200 g/L甘油、20 g/L Triton X-100、2 mmol/L PMSF和蛋白酶抑制剂混合物中裂解，冰浴1 h后1.2×104g离心30 min，收集上清液作为可溶性核蛋白进行分析。

1.5肺组织中IL-4、IL-5、IFN-γ和NF-κBp65的Westernbot检测参照文献[7]方法。收集细胞进行裂解获取蛋白，BCA方法测定蛋白浓度，每个泳道加样30 μg总蛋白，在100 g/L SDS-PAGE胶上120 V、90 min进行蛋白分离，分离的蛋白在250 mA、90 min电转移至PVDF膜上，50 g/L脱脂奶粉TBS-T缓冲液孵育1 h封闭膜上非特异性位点，分别加入相应的稀释抗体4 ℃过夜。第2天，洗膜后再用HRP标记的二抗杂交，37 ℃孵育1 h。洗膜后加ECL发光试剂，利用Gel Doc进行图像采集。

1.6BALF中细胞因子IL-4、IL-5和IFN-γ含量的ELISA分析具体操作按试剂盒说明书进行，结果的单位以pg/L表示。

1.7统计学处理采用SPSS 14.0进行分析，应用单因素方差分析和SNK-q检验比较各组BALF中细胞数目和炎症细胞因子水平、小鼠肺组织相关细胞因子和NF-κB p65的变化，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1各组小鼠BALF中炎症细胞的变化见图1、表1。Diff-quik染色结果显示，正常组以巨噬细胞为主，偶见淋巴细胞和中性粒细胞；模型组和AEBR低剂量组嗜酸性粒细胞数明显增多，占细胞总数的68%以上；AEBR中、高剂量组嗜酸性粒细胞明显减少，以巨噬细胞为主。各组BALF中细胞变化。与正常对照组比较，模型组BALF中炎症细胞总数和淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞计数明显升高(P<0.05)；AEBR中、高剂量组能明显降低哮喘小鼠BALF中炎症细胞总数和淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞数目(P<0.05)；单核细胞数目在各组之间无明显变化(P>0.05)。

A：正常组；B：模型组；C：AEBR低剂量组；D：AEBR中剂量组；E：AEBR高剂量组；箭头所示为嗜酸性粒细胞图1 各组小鼠BALF中炎症细胞变化(Diff-quik染色，×200)

×104/mL

*：与正常组比较，P<0.05；#：与模型组比较，P<0.05

2.2AEBR对BALF中IL-4、IL-5和IFN-γ水平的影响见表2。

2.3AEBR对小鼠肺部炎症的影响见图2。HE染色结果显示，正常对照组气道壁及气道软组织结构完整。模型组和AEBR低剂量组气道黏膜水肿，气道的平滑肌增厚明显，可见气道上皮脱落，在小的气管和血管周围可见大量的炎症细胞浸润，炎症细胞多层围绕着管腔周围。AEBR中、高剂量组气道和血管周围的炎症细胞明显减少，气道平滑肌增生不明显。气道结构性比较完整，结果表明AEBR能够明显抑制哮喘小鼠的肺部炎症。

表2 各组小鼠BALF中IL-4、IL-5和IFN-γ水平的变化(n=10) pg/L

*:与正常组比较，P<0.05; #:与模型组比较，P<0.05

A：正常组；B：模型组；C：AEBR低剂量组；D：AEBR中剂量组；E：AEBR高剂量组图2 各组小鼠肺部炎症的变化(SP，×200)

2.4AEBR对肺组织细胞因子IL-4、IL-5、IFN-γ蛋白表达水平的影响见图3、表3。与正常组相比，模型组小鼠肺组织中IL-4、IL-5蛋白表达增高，而IFN-γ蛋白表达降低(P<0.05)；AEBR中、高剂量组IL-4、IL-5蛋白表达明显降低，而IFN-γ蛋白表达明显升高(P<0.05)。AEBR低剂量组小鼠肺组织中IL-4、IL-5和IFN-γ蛋白表达水平与哮喘模型组相比差异无统计学意义(P>0.05)。

1：正常组；2：模型组；3：AEBR低剂量组；4：AEBR中剂量组；5：AEBR高剂量组图3 各组小鼠肺组织IL-4、IL-5和IFN-γ 蛋白的表达

组别IL⁃4IL⁃5INF⁃γ正常组0．031±0．0120．035±0．0230．852±0．031模型组1．105±0．128∗1．164±0．1850．395±0．114∗AEBR低剂量组0．891±0．1641．196±0．1210．242±0．093AEBR中剂量组0．513±0．099#0．389±0．091#0．875±0．081#AEBR高剂量组0．132±0．085#0．265±0．087#0．892±0．091#F212．532189．32478．561P<0．001<0．001<0．001

*:与正常组比较，P<0.05; #:与模型组比较，P<0.05

2.5AEBR对肺组织细胞质和细胞核中NF-κBp65表达的影响图4、表4。与正常组相比，模型组NF-κB p65核转位明显增加，细胞质中NF-κB p65明显减少(P<0.05)。AEBR中、高剂量组NF-κB p65核转位减少，细胞质中NF-κB p65表达明显增加(P<0.05)。AEBR低剂量组细胞质NF-κB p65和细胞核内NF-κB p65表达与哮喘模型组相比差异无统计学意义(P>0.05)。

1：正常组；2：模型组；3：AEBR低剂量组；4：AEBR中剂量组；5：AEBR高剂量组图4 各组小鼠肺组织中NF-κB蛋白的表达

分组细胞质NF⁃κBp65细胞核NF⁃κBp65正常组0．752±0．0150．554±0．031模型组0．422±0．123∗0．875±0．113∗AEBR低剂量组0．465±0．1410．818±0．122AEBR中剂量组0．792±0．091#0．642±0．091#AEBR高剂量组0．775±0．087#0．474±0．092#F15．36817．652P<0．001<0．001

*:与正常组比较，P<0.05; #:与模型组比较，P<0.05

3 讨论

哮喘气道炎症反应机制是复杂的多种炎症细胞反应。在过敏性气道疾病中，嗜酸性粒细胞浸润非常明显，被认为是哮喘的一个标志性病理特征[8-9]。本实验研究发现，给予150和300 mg/kg的AEBR灌胃治疗，能明显降低BALF中嗜酸性粒细胞数，同时细胞总数、中性粒细胞数和淋巴细胞数也明显降低。同时AEBR能明显降低哮喘下滑所的肺部炎症反应，表明AEBR能明显抗哮喘作用。

现在研究[10]普遍认为哮喘发病与Th1/Th2细胞失平衡有关。Th2分泌的细胞因子包括IL-4、IL-5和IL-13等，是体液免疫应答的重要介质，能够诱导IgE产生、促进气道嗜酸性粒细胞的浸润。此外，Th2细胞因子诱导组胺和白三烯释放与AHR相关联。Th1细胞因子如IFN-γ参与细胞免疫反应，这些细胞因子能够对抗Th2介导的免疫反应和减少IgE合成从而抑制哮喘的发生[11]。本实验结果表明，给予150和300 mg/kg的AEBR灌胃后，能明显提高哮喘小鼠肺组织IFN-γ蛋白表达并降低IL-4、IL-5蛋白表达，表明AEBR能够影响IFN-γ、IL-4和IL-5的表达，改变Th1/Th2细胞因子失衡，从而影响哮喘小鼠肺部炎症。暗示AEBR可能通过影响Th1/Th2细胞因子失衡来减轻哮喘小鼠肺部炎症。

NF-κB是非常重要的一种核转录因子，研究[12]表明，当包括T淋巴细胞等炎症细胞的NF-κB被激活后，能明显提高IL-4和IL-5蛋白质表达。本实验结果显示，OVA诱导建立的哮喘模型小鼠肺组织细胞质内NF-κB p65蛋白水平明显降低，而细胞核蛋白中NF-κB p65蛋白水平明显升高，提示哮喘过程中NF-κB被激活，由细胞质转位到细胞核中，启动包括IL-4和IL-5等靶基因的转录。而给予150和300 mg/kg的AEBR灌胃治疗后，AEBR能够提高哮喘小鼠肺组织细胞质内NF-κB p65的表达，减少了哮喘小鼠细胞核内的NF-κB p65的表达。提示AEBR能够抑制哮喘过程中NF-κB的活化，阻止NF-κB向细胞核内转位、抑制NF-κB p65活化转录功能，直接或间接影响Th1/Th2细胞因子失衡。

综上所述，AEBR能抑制哮喘小鼠气道和肺部炎症细胞浸润，AEBR的抑制哮喘炎症作用机制可能是通过抑制NF-κB活化从而影响Th1/Th2细胞因子失衡。

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