朱寒剑，李雷兵，钟晓凌，徐刘佳，曹 卫，杨 番，夏程程，李 琴，张智源，史文博，祁勇刚，周梦舟*

（1.湖北工业大学 工业发酵湖北省协同创新中心 湖北省食品发酵工程技术研究中心，湖北 武汉 430068；2.武汉市环境检测中心，湖北 武汉 430015；3.湖北省阿克瑞德检验检测有限公司，湖北 武汉 430077）

随着我国经济的发展，人们生活水平逐步提高，对健康的关注度也逐渐提升。益生菌因具有调节人体肠道菌群平衡的功能而得到消费者的青睐，因此益生菌发酵类的产品应运而生。硒位于元素周期表的第Ⅵ主族，是人体必需的微量元素。硒能提高人体的免疫力，在抗癌、抗氧化等方面都具有相应的功效，人体硒元素缺失会导致克山病、大骨节病等40多种疾病的发生[1]。无机硒本身是具有毒性的，大量的研究表明，微生物能富集无机硒，将其转化成为硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸等有机硒和单质硒，这些有机硒和单质硒毒性极低，且有抗氧化、清除自由基、提高免疫力、抗癌等保健功效。富硒益生菌将益生菌和硒的优点集于一身，经富硒益生菌发酵的食品既有益生菌的保健功效，同时又可以补充硒元素，可谓一举两得，因此成为了新的研究热点。目前对富硒益生菌及其发酵食品的研究主要集中在酵母菌、乳酸菌和双歧杆菌上，本文主要从益生菌对硒的富集与转化富硒益生菌的生理活性以及富硒益生菌的应用方面展开、为富硒益生菌的开发与富硒发酵食品的生产应用提供理论支撑。

1 益生菌的主要种类

1.1 乳酸菌

乳酸菌是一种革兰氏阳性菌，兼性厌氧，没有芽孢，主要包括乳酸杆菌属（Lactobacillus）、链球菌属（Streptococcus）、肠球菌属（Enterococcus）、乳球菌属（Lactococcus）等，是一种公认的最安全的可食用性益生菌。乳酸菌能够利用碳水化合物发酵产生大量乳酸，可用来制作酸奶、泡菜等发酵食品。具有调节肠道菌群，抑制致病菌的生长繁殖，调节免疫力等功能。同时具有很好的抗氧化性和防治乳糖不耐症等功效[2-3]。

1.2 双歧杆菌

双歧杆菌（Bifidobacterium）是一种革兰氏阳性菌，没有芽孢，形态为V、L或Y的厌氧菌，是人体肠道内重要的优势菌群。具有果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶（fructose-6-phosphate ketoenzyme，F6PPK），可以酵解葡萄糖成为乳酸和醋酸，降低肠道内的pH值，抑制致病菌的增长繁殖，从而改善人体的肠道环境。在免疫调节、抗肿瘤、抗菌消炎、抗衰老、降血脂、促进人体发育等方面起着重要的作用[4-5]。

1.3 酵母菌

酵母菌是一类真核单细胞微生物的统称，大多数为腐生，属于兼性厌氧菌，有性和无性方式繁殖。酵母菌是人们最早开始利用的微生物之一，可用来生产制作美味的食物和饮料，如糕点制品和酿酒等。酵母菌富含丰富的蛋白质及氨基酸、B族维生素、矿物质、多糖，还具有其他活性成分如麦角固醇、谷胱甘肽等，具有很高的营养价值[6-7]。

2 硒元素

2.1 硒的益处

硒是人体必需的微量元素之一，对维持人体健康具有重要的作用，人体硒元素缺失会导致克山病、大骨节病等40多种疾病的发生。硒在预防心血管疾病、抗氧化、抗衰老、抗病毒、抗癌、免疫功能调节等方面具有重要的作用[8]。硒与硫同属于第Ⅵ主族元素，具有相似的原子结构，所以硒元素能够取代氨基酸中的硫形成硒代氨基酸，并能够提高其合成蛋白质的活性。

2.2 硒的毒性与价态

摄入微量的硒对人体有益，但硒本身具有一定毒性，当摄入过量的硒元素就会引起硒中毒，摄入剂量＞20μg/g就会引起急性中毒。长期摄入过量的硒同样会引起慢性中毒，症状表现为摄食量减少，生长迟缓，脱发，肝硬化和贫血等。硒的毒性强弱与其存在的形态有关，无机硒如亚硒酸钠等毒性较强，胡滨等[9]发现，0.588 mg/kg剂量的亚硒酸钠对大鼠生长有抑制作用，半数致死量（medianlethal dose，LD50）为11.75 mg/kg，有中等积蓄中毒作用。而有机硒或单质硒毒性却相对较弱，马成瑗等[10]研究发现，当有机硒的质量浓度为313 mg/kg时，对小鼠也无毒副作用。硒主要以4种价态存在：硒酸盐SeO42-（+6）、亚硒酸盐SeO32-（+4）、单质硒Se0（0）和硒化物Se2-（-2）。毒性较强的无机硒主要以+4和+6价存在[11]。BENKO I等[12]用小鼠进行实验发现，Se的毒性按以下顺序降低：硒酸盐＞亚硒酸盐＞纳米硒＞酵母硒＞乳酸菌硒。

3 益生菌对硒的富集与转化

无机硒毒性较强，不易被吸收，有机硒和单质纳米硒则毒性相对低很多，且易于人体吸收，不过目前有机硒生产主要是用植物或者动物富集硒，然后再分离提纯，成本高，价格昂贵。许多微生物都有富集有益元素的功能，用益生菌对硒元素富集，将无机硒转化成有机硒，通过摄入这种富硒益生菌，达到补充硒元素的同时摄入益生菌的功效。且ALZATEA等[13]发现，富硒益生菌将无机硒转化成的有机硒不仅可以提高硒摄入量和利用率还不会引发毒性反应。

3.1 富硒乳酸菌

YANGJP等[14]在乳酸菌富硒的研究中，在不同条件下用德式乳杆菌亚种保加利亚乳杆菌（Lactobacillusbulgaricus，Lb）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus，St）进行了富硒培养，使用响应面方法学优化Se富集的初始pH、接种量和温度。结果表明，Lb和St的最适初始pH值、接种量和温度分别为5.96、6.73%、33℃和6.37、6.00%、40℃，保加利亚乳杆菌对硒的富集率达到了94.34%，嗜热链球菌则达到了97.05%。曾议霆等[15]对植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳酸菌（Lactococcuslactis）、干酪乳酸菌假植物亚种（Lactococcus lactis subsp.lactis）、嗜热乳酸杆菌（Thermophiluslactobacillus）、木糖乳酸杆菌（Lactobacillus xylose）5种共15株乳酸菌进行了富硒研究，在测定15株乳酸菌的生长曲线后选择在6 h时加入亚硒酸钠，此时乳酸菌正处于对数生长期的初期，培养24 h。通过对其中9株菌进行硒耐受能力测试得到最适宜的亚硒酸钠溶液添加质量浓度为6μg/mL，筛选出一株富硒能力较强的优势菌株，富硒量为425.79μg/g，硒转化率为27.00%，通过16SrDNA序列分析鉴定结果确定这株菌为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。乳酸杆菌可以将无机硒生物转化为硒代氨基酸，并参与癌症预防、甲状腺功能调节和病原体抑制[16]。这些硒代氨基酸主要是硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸、富硒生物质、二甲基硒、二甲基二硒以及单质硒等。其中硒代半胱氨酸是转化后的主要产物，它能够进一步被合成硒蛋白[17]。

3.2 富硒酵母

吴竞等[18]比较了啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae）、产朊假丝酵母（Candida utilis）、克鲁斯假丝酵母（Candida krusei）和葡萄汁酵母（Saccharomyces uvarum）4种酵母菌株在不同硒浓度下的硒耐受能力以及在相同硒浓度下的菌株生长状况和有机硒的转化率，研究发现啤酒酵母的硒耐受能力和富硒能力均为最强。在适宜的硒元素添加量下，啤酒酵母的活菌数为2.74×108CFU/mL，有机硒转化率为85.5%。李玉梅等[19]在对富硒酿酒酵母的选育及优化培养中通过紫外诱变筛选出一株富硒能力较强的酵母菌株，通过单因素试验及正交试验确定最优培养条件为起始pH 4.0，种子液接种量为10%（V/V），30℃培养28 h。此条件下培养的菌株干菌体富硒能力可达26.75 mg/g。富硒酵母中的有机硒大部分为硒代甲硫氨酸，可达70%以上，少部分为硒代半胱氨酸，另外还有少量的未知硒化合物[20]。硒代甲硫氨酸是合成人体硒蛋白的前体物质，所以硒代甲硫氨酸也是很多富硒酵母产品的质控标准之一。此外富硒酵母中还存在含硒多糖、含硒磷脂和含硒核酸等大分子化合物，但含量甚低且是否具有生物活性未知，有待进一步研究[21]。

3.3 富硒双歧杆菌

靳志强等[22]用动物双歧杆菌01研究了双歧杆菌的硒耐受能力以及最佳的富硒条件，结果表明，动物双歧杆菌01的最大硒耐受量为MRS培养基中硒质量浓度≤12μg/mL，最佳硒质量浓度为8μg/mL。在接种量5%培养48 h并在6 h时加硒富硒效果最佳。在此条件下培养其菌体硒含量可达（898±74）μg/g，硒转化率为（28.1±2.4）%。靳志强等[23]用富硒动物双歧杆菌01通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecyl sulphate-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE）分离得到了其中的硒蛋白组分，并采用氢化物发生原子吸收光谱（hydridegeneration atomic absorption spectrometry，HGAAS）法测定了其中的硒含量。结果显示，有16.7%～39.6%的无机硒被吸收了，其中77.4%～86.6%被转化成了有机硒，包括硒蛋白、硒多糖和硒核酸，分别占50.7%～63.0%，9.62%～18.70%和0.273%～0.754%。在硒蛋白中，硒主要存在于分子质量≤20 kDa的蛋白或肽链中。通过高效液相色谱-电感耦合等离子-质谱（high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry，HPLC-ICP-MS）测得硒蛋白中主要的硒氨基酸为硒代蛋氨酸，占（59.55±0.13）%。此外由于缺少标准物质，部分小分子硒化物无法确认[24]。

4 富硒益生菌的生理活性

4.1 富硒乳酸菌

目前关于乳酸菌的研究进展主要集中在其抗氧化、抗菌及抗癌等领域。研究表明，富硒乳酸菌的无细胞提取物比不含硒的同种乳酸菌无细胞提取物对·OH的清除率高4.55%～17.58%，同时其超氧化物歧化酶（superoxide diamutase，SOD）的酶活最高，是不加硒的对照组的2.14倍，谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）的酶活也有显著的提高[25]。含有元素硒的短乳杆菌的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力（36.5±1.31）%和还原力（OD700nm值=0.14）都显著高于对照组[26]。正是因为硒元素可以提高如SOD和GSH-Px等抗氧化酶的酶活进而能提高其抗氧化性。同时还有研究表明，乳酸菌胞外多糖经过硒化修饰后其总抗氧化能力和对·OH的清除能力都有明显的增强[27]。在抗菌活性方面，与乳酸菌相比，富硒乳酸菌对常见食源性病原体（如体外抗致病性鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增多性李斯特氏菌等）不论是富硒乳酸菌的培养溶液还是无细胞培养上清液均具有更强的抗菌活性[28]。用二氧化硒处理乳酸菌后其培养液和无细胞培养物对白色念珠菌的抑制效果均有明显增强，说明乳酸菌富硒后其抗真菌活性也能得到增强[29]。硒本身就具有良好的抗癌活性，乳酸菌可将硒离子还原为元素硒纳米颗粒（selenium nanoparticles，SeNPs）并将其沉积在细胞内空间中。在小鼠实验中，食用富含SeNPs的短乳杆菌的乳腺癌小鼠其自然杀伤（natural killer，NK）细胞活性和迟发型超敏反应（delayed type hypersensitivity，DTH）应答显著提高，寿命延长，同时降低了肿瘤向肝转移的概率[30]。与单独食用植物乳杆菌或对照小鼠相比，处理小鼠的肿瘤体积减小并且其存活率显著增加。通过食用SeNPs富集的乳酸菌可提高促炎细胞因子干扰素的小鼠（interferon-γ，IFN-γ），肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）水平并增加NK细胞活性，从而诱导有效的免疫应答，因此，可能会为癌症的治疗提供一种选择[31]。

4.2 富硒酵母菌

富硒酵母作为一种生物富硒的方式很早便已被开发，富硒酵母有着多种优良的功能。周娜[32]研究发现，添加亚硒酸钠后酵母菌的GSH-PX活性明显提高，最高可达到初始酶活的3倍，同时还能促进酵母菌生长提高生物活性，与氨基酸同时使用其效果会更佳。在对妊娠期的太行黑山羊补充硒酵母之后收集其血液样本测试发现，GSH-Px活性、SOD活性和总抗氧化能力（total antioxidantcapacity，T-AOC）活性都得到明显提高，除此之外还可以刺激雌二醇、孕酮和T-4的产生[33]。在家禽的日粮中添加富硒酵母，也可以获得类似的效果[34]。将富硒酵母与阿拉伯胶联用于四氯化碳导致慢性肝损伤的大鼠上，可明显改善慢性肝损伤，具有抑制炎症并抑制促纤维化反应以及支持肝再生的作用。且二者联用效果好于仅用富硒酵母或阿拉伯树胶[35]。用富硒酵母作为硒补充剂喂食患乳腺肿瘤的小鼠，发现硒在肿瘤中的积累可能诱导氧化应激和p53依赖性促氧化细胞凋亡，从而抑制乳腺肿瘤的生长[36]。同样，在富硒酵母对人乳腺癌细胞氧化应激，生长抑制和凋亡的影响实验中，将富硒酵母处理雌激素受体（estrogen receptor，ER）阳性、人乳腺癌细胞系（michigan cancer foundation-7，MCF-7）和三阴性人乳腺癌细胞，发现富硒酵母能抑制这些癌细胞的生长，且抑制效果比单独用有机硒好。100～1500 ng Se/mLSe酵母的剂量可以增加氧化应激，并刺激乳腺癌细胞系中的生长抑制效应和凋亡诱导，但不影响非致瘤细胞[37]。用富硒酵母喂食对认知功能障碍和神经病理学三转基因阿尔兹海默症模型小鼠（triple transgenic mouse model of Alzheimer disease，3xTg-AD）3个月，结果表明，富硒酵母显著改善了3xTg-AD小鼠的学习和记忆，促进了神经元活性，减弱了星形胶质细胞和小胶质细胞的激活，减轻了突触缺陷，并且抑制了糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthasekinase-3β，GSK-3β）的活性，说明膳食补充富硒酵母对阿尔兹海默症（Alzheimer disease，AD）的预防或治疗产生多重有益作用。这些发现也为用富硒酵母治疗AD提供了潜在证据[38]。富硒酵母还能改善玉米赤霉烯酮产生的损伤，健康雄性昆明小鼠在单次口服玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）之前，先喂食富硒酵母14 d，48 h后采集血液进行分析，发现淋巴细胞、血小板、白细胞、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶等大部分参数与未处理的对照小鼠类似，这些结果表明，预服用硒酵母可有效改善ZEN诱导的损伤效果[39]。

4.3 富硒双歧杆菌

目前关于富硒双歧杆菌的研究相对酵母菌和乳酸菌较少，因为双歧杆菌本身就具有抑制多种癌细胞增长和成瘤的作用，而硒也有很好的防癌抗癌功效，所以对其的研究主要集中抗氧化和抗癌方面。张素姬等[40]研究发现，质量浓度100μg/mL的富硒长双歧杆菌总蛋白能抑制黑色素瘤细胞，且效果明显好于长双歧杆菌总蛋白和抗肿瘤化疗药物5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）。此外，将富硒长双歧杆菌总蛋白与5-FU联用能协同抑制黑色素瘤细胞。将转白细胞介素2（interleukin2，IL2）质粒导入到长双歧杆菌并富硒培养，得到含IL2基因质粒的富硒双歧杆菌（Se-B.longumIL2）。通过荷肝癌H22的小鼠尾静脉注射Se-B.longumIL2，发现能较好的抑制肿瘤并能延长荷肝癌小鼠的生存时间[41]。5-FU作为抗肿瘤药物会引起化疗性肠粘膜炎，临床症状主要表现为恶心、呕吐、食欲下降、体质量减轻和腹泻等。通过腹腔注射5-FU可建立小鼠肠黏膜炎模型，在喂食富硒双歧杆菌后能明显改善小鼠的肠黏膜炎，有效降低腹泻发生率及严重程度和小鼠的死亡率[42]。双歧杆菌具有很强的抗氧化活性，富硒后动物双歧杆菌01蛋白的抗氧化活性得到显著提高，对各种自由基的清除能力，还原能力都得到了提高[43]。

5 富硒益生菌在食品中的应用

5.1 富硒发酵面包

面包是最常见的由酵母发酵出来的食品，而用富硒酵母发酵出来的富硒面包也是最常见富硒发酵食品。通过食用富硒面包可以满足人体对硒的日常需求。因为由酵母发酵而来，所以富硒面包中的硒主要以硒代蛋氨酸的形式存在，一般＞65%[44]。SANCHEZ-MARTINEZ M等[45]研究了实验室规模的富含硒蛋氨酸的白色和全麦面包的制备。结果发现使用新鲜富硒酵母发酵的面包比直接将亚硒酸盐添加到面团中发酵出来的面包要好，无论是品质还是硒代蛋氨酸的含量。用同位素稀释分析测得白面包和全麦面包中的硒含量分别为（1.28±0.02）μg/g和（1.16±0.02）μg/g，经高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）测得硒代蛋氨酸时主要硒物种约占总硒的80%。通过体外胃肠消化测定法分别测得白色和全麦富硒面包提供100%和40%的硒生物可接受性值。汪雪雁等[46]通过单因素和正交试验结合并用感官评价的方法确定了富硒面包的最佳工艺条件为1%富硒酵母，0.7%食盐，20%绵白糖，发酵5 h。此条件下发酵出来的富硒面包色泽、风味和口感均达到最佳状态，且硒含量为0.492 1 mg/kg。且作为最常见的富硒发酵食品，目前已有多项富硒面包的市场化专利，如富硒花生面包、富硒生姜面包、富硒抹茶面包等，口味多样种类繁多。

5.2 富硒发酵酸奶

酸奶是鲜牛奶和糖混合后通过乳酸菌发酵得到的一种发酵食品，因发酵过程中乳酸菌将乳糖和蛋白质分解成小分子的半乳糖、乳酸、多肽、氨基酸等因此更好消化吸收，有很好的营养价值和保健作用且风味独特[47]。DENGY等[48]分离得到一株富硒性能良好且能将亚硒酸钠还原为单质硒的短乳杆菌（Lactobacillusbrevis），将该株短乳杆菌在脱脂牛奶中与嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）和保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）共发酵得到了富硒酸奶，且其中的单质硒也显著增加。刘冬等[49]将青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）ys01和干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）ys05以2∶1的比例富硒培养之后用于发酵酸奶，发现具有良好的发酵性能，其有机硒含量为（17±4.5）μg/kg。将长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）与嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）以2∶1的比例富硒培养，混合菌接种量3%，硒的质量分数8μg/g并添加1.00%的低聚果糖，在pH 6.5的条件下发酵羊奶其中硒含量可达33.46μg/kg。陈鹤[50]将短乳杆菌活化后接入含有亚硒酸钠的培养基中，用该菌作为辅助发酵剂，保加利亚乳杆菌和嗜热乳链球菌的发酵剂作为主发酵剂发酵得到一种富硒发酵酸奶。此外通过加入不同的配料还可以制得各种不同口味的酸奶。

5.3 其他富硒发酵食品

除了富硒发酵面包和酸奶这两种最常见的富硒发酵食品之外，也还有许多其他的富硒发酵食品。巫锦通等[51]人通过单因素和正交试验结合感官评定制得了一种夹酥均匀、口感酥脆的营养富硒型发酵饼干。夏元振等[52]用富硒酵母、安琪面包酵母、小麦粉、玉米粉、燕麦粉、西兰花、金针菇、鸡蛋等丰富原料制作出了营养美味的富硒发酵饼干，其中硒含量为6.31μg/100g。PEREZ-CORONA TM等[53]在白葡萄汁中添加酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和亚硒酸钠发现，产生葡萄酒的酒精发酵不受硒存在的影响，发酵21 d后分析得其中的硒主要以硒代蛋氨酸为主。DECIRIANOM GI等[54]用富硒酵母2 g/kg、碘化盐26 g/kg、亚麻籽、藻类和天然抗氧化剂686 mg/kg，生产干燥的发酵香肠，其技术和感官特性与传统香肠相似。章金梅等[55]在榨菜的腌制过程中等比例的添加乳酸菌和亚硒酸，最后得到风味更好，亚硝酸盐更低的富硒榨菜。

6 总结

益生菌在人体内起着平衡肠道菌群的作用，对人体的健康起着重要作用。益生菌富硒后能将无机硒经过生物转化变为有机硒，这些有机硒比无机硒毒性更低更为安全，主要为硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸，这些有机硒可被进一步合成硒蛋白，能提高如SOD、GSH-Px等抗氧化酶的活性，从而提高富硒益生菌的抗氧化性。从富硒量上来看，酵母的富硒能力最强，最高可达26.75 mg/g，但相对来说富硒乳酸菌和富硒双歧杆菌有更好的抗氧化活性、抗菌活性和抗癌活性，利用富硒益生菌开发的食品主要为面包、饼干、酒、酸奶、香肠、榨菜等发酵食品。富硒面包中有机硒一般＞65%且表现出很好的生物可接受性，相同的富硒酸奶中的有机硒也表现出很好的生物可接受性。硒并不会影响这些食品的品质、外观和口感，反而每日摄入适量的此类食品能满足人体每天对硒的需求。基于富硒益生菌及其发酵食品能同时起到安全补充硒元素和补充益生菌这两种功效，未来具有良好的发展前景。不过关于富硒益生菌目前还存一些问题，如其中的一些有机硒还不能确定，同时对其活性和功效未知。用富硒益生菌发酵的食品在感官上并无优势，只具有功效上的优势，且民众是否能接受等。因此，未来富硒益生菌的研究应更注重于对其富硒机制的解析，以及富硒对于发酵食品体系的风味、组分相互作用的影响等方面的研究，为富硒益生菌产品的开发提供新的思路和理论依据。