李鑫楠 王 洁 李 涛 刘慧娟 徐 明 董福生

龋病是多种因素引起的不可逆性疾病，导致龋病病因包括细菌及菌斑、食物、宿主及口腔环境等[1]。人类口腔是一个复杂的生态环境，细菌、饮食、遗传等共同维持着口腔健康的动态平衡，口腔中一种或多种因素改变时，这种平衡被打破，龋病就会发生[2]。细菌是打破这种平衡的主要因素，因此，龋病被认为是由细菌引起的一种感染性疾病[3]。目前已公认变异链球菌是口腔主要的致龋菌之一[4]。

关于变异链球菌相关致龋机制的研究，多数集中在细菌的染色性、菌落形态、生化特性、代谢产物以及对菌斑生物膜影响的分析上。罕有分子水平上的研究。但细菌在不同环境中生存导致基因突变，产生不同的基因类型。基因突变对细菌的生长特别是细菌的毒力造成一定的影响[5]。故基因突变是引起致龋菌致龋毒力改变的重要原因。目前，根据基因突变率判断变异链球菌致龋能力的研究未见报道。

本研究接受了于2015年7月～2016年2月期间，在河北医科大学口腔医院接受窝沟封闭治疗的石家庄市8～12岁学龄儿童，进行龋病的问卷调查，分析学龄儿童睡前零食与刷牙情况对龋病的影响。设计变异链球菌的特异性引物，提取学龄儿童的口腔牙菌斑进行PCR扩增，对PCR阳性的变异链球菌进行核酸序列分析。确定变异链球菌在分子水平和基因位点上的突变，确定其突变率及致龋能力，探讨儿童龋病发生与致龋菌基因突变的关系。

资料和方法

一、临床资料

本研究选取2015年7月～2016年2月期间，在河北医科大学口腔医院接受窝沟封闭治疗的石家庄市（外国语学校、师大附小、十里铺小学、方北小学）8岁～12岁学龄儿童。调查对象共60名儿童，分为龋病组30例，无龋组30例。采用问卷调查，收集龋病发病的临床资料。

按照WHO口腔健康标准，采集口腔牙菌斑样本。由口腔专业医师按照全国口腔流行病学调查标准对60名儿童进行口腔检查。儿童纳入标准，龋病组为除龋病外无其他口腔疾病，无家族遗传疾病，无系统性疾病，无长期服药史，近3个月无抗生素服用史。无龋组为无充填体，无龋坏征象的完整牙（龋洞形成前阶段及其它类似早期龋的情况，诊断不可靠，不作为龋病纳入）。

二、实验方法

1.临床资料的收集：进行口腔检查的同时，对60名学龄儿童进行临床资料的收集，针对其日常生活中零食摄入情况和刷牙情况进行问卷调查，同时记录检查结果。

2.牙菌斑的收集：接受检查的学龄儿童用0.9%的生理盐水漱口。隔湿后用消毒的刮匙刮取牙体表面的牙菌斑，并将其置于含1.5ml TE缓冲液的冻存管中，标号。液氮罐中速冻后于-20℃冰箱中冻存。

3、细菌总DNA的提取：取冻存的牙菌斑标本解冻，离心，7500rpm 10min，弃上清。加入180μl溶菌酶裂解液，37℃温育30min。加入25μl蛋白酶K和200μl buffer AL，震荡混匀。56℃温育30min，加入200μl无水乙醇，震荡混匀。将混合液移至带有吸附柱的采集管中，离心，8000rpm 1min，弃采集管。将吸附柱置于新的采集管中，加入500μl buffer AW1，8000rpm离心1min，弃采集管；将吸附柱置于新的采集管中，加入500μl buffer AW2，14000rpm离心3min，弃采集管。将吸附柱置于干净的1.5ml的离心管中，在吸附膜上直接加入100μl buffer AE，室温放置1min，8000rpm洗涤2min。重复洗涤一次，将提取的DNA样本于-20℃的冰箱内保存备用。

4.变异链球菌的PCR扩增：Primer 5.0软件以及BLAST设计变异链球菌的特异性引物：F：5ˊ-AGC GTT GTC CGG ATT TAT TGG-3ˊ；R：5 ˊ-AGA GCA CAC TAT GGT TGA GCC A-3ˊ，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系：Taq pcr Maste Mix（12.5μl），10μm 正反向引物（各 1μl），DNA 模板（5μl），用无菌双蒸水补充至总体积 25 μl。PCR反应条件：initial denaturation（94℃，4min），denaturation（94℃，40s），annealing （55℃，30s），extension （72℃，30s），final extension（72℃，7min）。

5.琼脂糖凝胶电泳：2%的琼脂糖加热至澄清、透明。冷却至50℃时取25ml加入2ml EB。将加入EB的琼脂糖倒入凝胶盘中，凝固后拔除梳齿。将凝胶盘放入电泳槽内，加足量1×TBE缓冲液。取5μl PCR扩增产物与1μl上样缓冲液混合后加入加样孔。接通电源，调电压至60V，当染料距胶沿1～2cm处，停止电泳。紫外灯下观察，记录电泳结果。

6.核酸序列测定：测序过程由上海生工生物工程测序部协助完成。

三、统计学分析

SPSS 21.0软件进行统计学分析，采用卡方检验检测变异链球菌菌属，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

SPSS 21.0软件进行统计学分析，采用秩和检验检测龋病组与无龋组变异链球菌的突变率，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、问卷调查结果

问卷调查显示，龋病组与无龋组60名学龄儿童在睡前饮料、睡前甜点以及早晚刷牙的问题上，差异无显著性（图1）。

图1 龋病组与无龋组的临床问卷调查结果

二、PCR扩增结果

所有样本PCR扩增后，产物经2%琼脂糖凝胶电泳，均显示出一条清晰的条带，长度102bp。其中龋病组变异链球菌阳性结果21例（图2、图3），阳性检出率70%；无龋组变异链球菌阳性结果10例（图4），阳性检出率33.3%。

对60名学龄儿童的变异链球菌检出数据进行统计学分析，结果显示龋病组与无龋组差别有显著性，P＜0.05。研究结果表明，变异链球菌是学龄儿童龋病发生的主要致龋菌（表1）。

图2 龋病组变异链球菌的PCR扩增

图3 龋病组变异链球菌的PCR扩增

图4 无龋组变异链球菌的PCR扩增

表1 龋病组与无龋组变异链球菌检出率的统计学分析

三、变异链球菌细菌突变类型的核酸序列测定

龋病组与无龋组变异链球菌阳性检出病例的PCR扩增产物经过核酸序列测定，31例阳性检出病例中变异链球菌出现多种基因突变类型，龋病组变异链球菌突变率达12.7%～31.3%，平均21.3%。无龋组变异链球菌突变率达32.3%～39.2%，平均36.1%。个别病例变异链球菌基因突变涉及40个碱基。表明变异链球菌存在多种基因突变类型（图5～6）。

对31例变异链球菌阳性检出病例中变异链球菌的突变率进行统计学分析，结果显示龋病组与无龋组变异链球菌突变率差异有显著性（P＜0.05）。无龋组变异链球菌的突变率高于龋病组变异链球菌的突变率（表2）。当变异链球菌的突变率达到36.14%及以上时，直接影响了变异链球菌的致龋能力。

图5 龋病组病例5：变异链球菌突变率12.7%

图6 无龋组病例007：变异链球菌突变率39.2%

表2 龋病组与无龋组变异链球菌突变率的统计学分析

讨 论

龋病是细菌引起的一种感染性疾病，也是口腔颌面部的常见病和多发病[6]。口腔致龋菌通过形成牙菌斑，贴附在牙体表面，破坏牙体组织。牙菌斑是由口腔微生物细胞与胞外多糖组成的复杂三维结构，是一种典型的细菌性生物膜，所以牙菌斑是致龋菌的聚集地。它是细菌在牙面上代谢和致病的生态环境，是龋病发生的始动因子。牙菌斑的致龋作用与致龋菌的代谢活动有关。牙菌斑内的细菌之间存在相互凝集、营养、竞争、拮抗及新陈代谢的互利共生关系。牙菌斑形成早期，各菌属间处于动态平衡阶段，抵御外来细菌的侵入，共同维护宿主。一旦菌属间的动态平衡被打乱，细菌之间的相互作用发生变化，龋病就会发生[7]。

变异链球菌被证实是口腔主要致龋菌。变异链球菌在牙菌斑中充分发挥其产酸性，耐酸性和合成胞内外多糖的特性，导致龋病的发生[8]。变异链球菌对牙齿有很高的亲和力，其对牙齿的选择性黏附与致龋性密切相关，对牙齿表面的黏附作用使得牙齿龋患增加。研究表明牙菌斑中更容易收集到导致龋病发生的变异链球菌[9]。因此，本研究取样部位采取了没有龋损的颊舌侧釉质表面的牙菌斑，以保证获取有效的样本量。

儿童也是龋病的好发人群，由于儿童与成年人的生活习惯存在很大的差别，本项研究设计了问卷调查，以了解儿童的生活习惯与龋病发生的关系。在对60名学龄儿童的问卷调查中发现，龋病组与无龋组学龄儿童普遍存在睡前饮料和睡前甜点的现象。但龋病组与无龋组学龄儿童睡前饮料和睡前甜点对龋病的发生，差别无显著性。问卷调查的另一项是关于刷牙情况的调查，结果显示被调查的学龄儿童均养成了刷牙习惯。问卷调查结果表明龋病的发生虽然是多因素引起的，但细菌仍是关键的致病因素[10，11]。可能由于无龋组学龄儿童口腔内致龋菌的致龋能力较弱，不足以导致龋病的发生。针对龋病组儿童晚刷牙者多于无龋组儿童的现象，不排除龋病组儿童刷牙方式不正确或刷牙时间不充足的问题。提示应该加强学龄儿童的正确刷牙方式的教育。

龋病的致病因素包括细菌，食物，宿主及时间。临床及生活中常常可见暴露于高致龋风险因素中的人群，其患龋率较低；而较少暴露于致龋因素的人群，其患龋率却很高。提示龋病风险的评估存在局限性，可能忽略了个体遗传及致龋菌基因突变对龋病的影响。本次研究中，儿童饮食习惯及刷牙情况对龋病的发生无显著性差别，故影响龋病致病的因素可能是宿主本身与细菌。动物实验和流行病学调查研究证明，遗传因素对龋病的发生有关[12]。基于以上理论，我们提出细菌的基因突变类型不同，导致致龋能力存在差异的设想。

PCR技术具有高度特异性和高度敏感性，对于变异链球菌的鉴定具有独特的优势[13]，通过设计变异链球菌的特异性引物，经变异链球菌PCR证实60例学龄儿童样本中，31例含有变异链球菌，其中龋病组21例，无龋组10例。龋病组除21例阳性病例外，存在9例阴性病例。有研究表明，儿童龋病致病菌除变异链球菌外，还发现乳杆菌与内氏放线菌也是儿童龋病发生的致病菌[14，15]。龋病组中有9例变异链球菌阴性的病例，可能由个体遗传及其他致龋菌导致，如乳杆菌、内氏放线菌等。无龋组30名学龄儿童中，变异链球菌检出10例，但未发生龋病。核酸序列测定分析发现，这些变异链球菌存在极大的基因突变。这种基因突变可能导致细菌的致龋力下降，即使感染，并未致龋。虽然这些儿童口腔内变异链球菌致龋能力较弱，但仍存在潜在的龋病发病风险[16]，应定期随访检查，密切关注龋病的发生。

国内同行的研究多数集中在致龋菌的染色性、菌落形态、生化特性和代谢产物以及对菌斑生物膜的影响上[17～21]，罕有涉及细菌不同基因类型致龋能力的研究。变异链球菌核酸测序结果显示，变异链球菌存在多基因突变类型。本研究将龋病组与无龋组扩增出的31例变异链球菌阳性病例与国际标准的变异链球菌ATCC25175菌株在基因学上进行对比，发现变异链球菌存在不同的基因类型，并且其突变率存在差异。核酸测序结果显示儿童致龋菌的变异链球菌突变率达12.7%～39.2%。研究结果表明，导致儿童龋病的变异链球菌存在多种基因类型。变异链球菌不同基因类型的产生与遗传及其所处的环境有关，个体口腔内pH值的差异、氟含量以及糖含量等的差异引起口腔环境的不同[22]。此外，个体基因上的差异以及刷牙、窝沟封闭、其他预防措施的采取，也会导致口腔内环境的差异[23，24]。细菌遗传物质的变化或者细菌受到环境因素的影响均可导致细菌发生变异，使子代细菌的生物性状与宗带不同，从而产生了多种基因类型。

龋病组变异链球菌突变率为12.7%～31.3%，无龋组变异链球菌突变率达32.3%～39.2%。对两组变异链球菌突变率进行分析，证实龋病组与无龋组变异链球菌突变率的差异有显著性，无龋组变异链球菌突变率高于龋病组。结果提示突变率过高影响了变异链球菌的致龋能力。研究证明不同人群变异链球菌基因型存在差异，不同变异链球菌基因型的致龋能力也存在差异[25]。并且变异链球菌的致龋能力具有遗传性[26]，即使同属一个种群，不同菌株的遗传性也存在一定的差异[27]。龋病易感性与口腔中变异链球菌的基因类型有关[28]。可以认为，变异链球菌的突变率直接影响了龋病的致龋能力。当变异链球菌突变率达到或超过36.14%水平时，变异链球菌的致龋能力明显下降或丧失致龋能力。此时，变异链球菌性质属于低毒力致龋菌株或非致龋菌株。

这一研究成果可应用于临床，在临床防治儿童龋病时，采用核酸序列测定的方法确定龋易感儿童的感染菌，针对龋易感儿童采取有效的防治措施。

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