冯丽丽，燕照玲，陈海燕，段俊枝，杨艳艳，孙怀昌

(1.河南省农业科学院 农业经济与信息研究所，河南 郑州 450002; 2.河南省农业科学院 动物免疫学重点实验室，河南 郑州 450002； 3.扬州大学 兽医学院,江苏 扬州 225009)

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一种主要以妊娠母猪发生流产、早产等繁殖障碍和新生仔猪发生呼吸道疾病为特征的传染病[1-2]。PRRS最早于1987年在美国被报道，之后迅速蔓延，在世界上大多数养猪国家都有报道[3-4]。我国于1996年首次从病料中分离到PRRSV，从而证实了PRRS在我国猪群中存在[5]。之后PRRS在我国持续存在，一直长期流行，对我国生猪养殖业造成了重大的经济损失[6-13]。

PRRSV在猪体内具有典型的宿主细胞亲嗜性，主要感染猪肺泡巨噬细胞[14]。猪肺泡巨噬细胞是PRRSV主要的天然宿主细胞，原代分离培养的猪肺泡巨噬细胞可用于病毒的分离。从猪的子宫内可分离到PRRSV，猪的子宫内膜细胞也是PRRSV的天然宿主细胞[15]。病毒的宿主细胞亲嗜性是由细胞上的病毒受体决定的，PRRSV感染宿主细胞的第1步是与细胞膜上的细胞受体结合，从而介导病毒感染细胞[16]。在PRRSV的天然宿主细胞猪肺泡巨噬细胞中，主要有唾液酸黏附素受体(sialoadhesin,Sn)和清道夫受体B(scavenger receptor B,CD163)等，其中CD163分子是PRRSV的主要细胞受体[17-19]。单独转染CD163分子，可将PRRSV非易感细胞变为易感细胞[20]。因此，探索CD163分子在PRRSV感染宿主细胞过程中的作用，对研究PRRSV的致病机制具有重要意义。鉴于此，研究了CD163分子对PRRSV感染猪子宫内膜内皮细胞的影响，以期为PRRSV致病机制的研究提供参考，为PRRS的防控奠定基础。

1 材料和方法

1.1 病毒株、细胞及质粒

VR2332株PRRSV、猪子宫内膜内皮细胞、Marc-145细胞、包含CD163分子全长的重组质粒pVITR-CD163均由扬州大学兽医学院微生物实验室保存。

1.2 主要试剂

ExTaqDNA聚合酶、RNAiso Plus试剂、M-MLV反转录试剂盒等购自大连宝生物工程有限公司；DMEM培养基、非必需氨基酸购自GIBCO公司；用于培养 Marc-145 细胞的改良 DMEM培养基购自北京清大天一科技有限公司；胎牛血清(FBS)购自杭州四季青生物工程有限公司；LipofectamineTM2000转染试剂购自Invitrogen公司；无内毒素质粒提取试剂盒购自Roche公司；Cy3标记的山羊抗小鼠IgG购自康为世纪生物科技有限公司；抗猪CD163的小鼠免疫血清由扬州大学兽医学院微生物实验室制备[21]。其他试剂均为国产分析纯。

1.3 引物设计

参考GenBank中猪CD163分子序列，应用Primer Premier 5.0软件设计引物，CD163-F：5′-TGTGAAGTGCTGTCAGTTCT-3′，CD163-R：5′-AAATGTGTCCAGTTCCCTCACT-3′。预期扩增片段大小为495 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 重组质粒pVITR-CD163转染猪子宫内膜内皮细胞

将含不同质量浓度的潮霉素B(50～500 μg/mL)加入培养液中，筛选7～10 d内能够杀死所有细胞的潮霉素B的最小质量浓度。若细胞对潮霉素B敏感性高，在确定的筛选质量浓度范围，再按10 μg/mL的梯度进行筛选，最终确定最佳筛选质量浓度。用无内毒素质粒提取试剂盒提取重组质粒pVITR-CD163，将提取的无内毒素质粒按LipofectamineTM2000转染试剂说明转染猪子宫内膜内皮细胞，以pVITR载体质粒转染组为对照。转染后培养液中加入确定的潮霉素B筛选质量浓度，筛选阳性克隆并扩大培养。

1.5 CD163分子的表达检测

1.5.1 RT-PCR检测 在24孔板中培养CD163分子转染的猪子宫内膜内皮细胞，细胞密度达到90%时，按RNAiso Plus试剂说明提取细胞总RNA，反转录为cDNA。用CD163检测引物进行PCR扩增。反应条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测分析，并将扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.5.2 间接免疫荧光试验 在96孔板中培养CD163分子转染的猪子宫内膜内皮细胞，细胞密度达到80%时，用预冷的固定液(V丙酮∶V乙醇=3∶2)固定10 min，加入含5%脱脂奶粉的封闭液，4 ℃过夜，以抗猪CD163的小鼠免疫血清为一抗，以Cy3标记的山羊抗小鼠IgG为二抗进行间接免疫荧光试验，倒置荧光显微镜下观察结果。

1.6 CD163转基因细胞感染PRRSV试验

在24孔板中培养CD163分子转染的猪子宫内膜内皮细胞(以pVITR载体质粒转染细胞为对照)，细胞密度达到70%～80%时，加入0.1 MOI 的VR2332株PRRSV，37 ℃孵育1 h，用含2% FBS的DMEM培养基培养，分别在感染后24、36、48、72 h收集细胞培养物。将不同时间点收集的细胞培养物分别反复冻融3次，高速离心后收集上清。

在96孔板中培养Marc-145细胞，将收集的上清10倍倍比稀释，加入Marc-145细胞培养孔内，37 ℃孵育1 h，用含2% FBS的DMEM培养基培养。每天观察细胞生长情况，直至无细胞病变孔出现。按Karber法计算TCID50。

2 结果与分析

2.1 猪CD163分子表达的检测

2.1.1 RT-PCR检测 提取CD163转染的猪子宫内膜内皮细胞RNA，反转录为cDNA，用CD163检测引物进行PCR扩增。结果显示，转染空载体的细胞中无扩增条带，CD163转染组在约500 bp处出现特异性扩增条带，与预期大小一致(图1)。测序结果显示，扩增产物为猪CD163编码序列。

M.DL2000 Marker;1.转染pVITR-CD163质粒;2.转染pVITR质粒

2.1.2 间接免疫荧光检测 对CD163转染的猪子宫内膜内皮细胞进行间接免疫荧光试验，以抗猪CD163的小鼠免疫血清为一抗、Cy3标记的山羊抗小鼠IgG为二抗进行荧光染色。荧光显微镜下观察可见，CD163转染的猪子宫内膜内皮细胞出现预期的荧光，而转染空载体的细胞无荧光出现(图2)。

A.转染pVITR-CD163质粒;B.转染pVITR质粒

2.2 CD163分子对PRRSV复制的影响

用PRRSV感染CD163转染的猪子宫内膜内皮细胞，在感染后不同时间点收获PRRSV子代病毒并测定TCID50。结果显示，随感染时间增加，PRRSV子代病毒TCID50均提高；同一时间点CD163转染细胞组的PRRSV子代病毒滴度均稍高于空载体转染细胞组，但差异不明显(图3)。

图3 CD163分子转染猪子宫内膜内皮细胞的PRRSV滴度测定

3 结论与讨论

病毒受体是指能特异性地与病毒结合、介导病毒侵入细胞，从而促进病毒感染的特殊性细胞表面位点。病毒受体决定了病毒的宿主范围及对组织、细胞的亲嗜性[22]。研究表明，CD163是PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞的重要受体，主要与PRRSV的复制有关[20]。Weingartl等[23]构建猪肺泡巨噬细胞系，发现其对PRRSV不易感。进一步研究发现，构建的猪肺泡巨噬细胞系不表达巨噬细胞的表面标记CD163分子，将CD163分子转染猪肺泡巨噬细胞，表达CD163分子的猪肺泡巨噬细胞系对PRRSV表现为易感[24]。由此可知，CD163分子在PRRSV的感染过程中扮演着重要角色。PRRSV可以感染猪子宫内膜内皮细胞，但RT-PCR检测及间接免疫荧光试验结果均表明，猪子宫内膜内皮细胞表面不表达CD163分子[25]。可见，PRRSV感染猪子宫内膜内皮细胞的机制不同于猪肺泡巨噬细胞。

Wang等[26]研究发现，PRRSV在体内不感染外周血单核细胞，但是从血液中新分离的外周血单核细胞经体外培养后部分细胞对PRRSV易感，并且发现PRRSV的感染滴度随着细胞表达CD163分子的增多而增高。据此推测，PRRSV感染猪子宫内膜内皮细胞可能随着CD163的表达而增强。本研究将CD163分子转染猪子宫内膜内皮细胞，成功构建了表达CD163分子的猪子宫内膜内皮细胞系。病毒感染试验结果表明，PRRSV的感染滴度没有随着CD163分子的表达而增高，转染CD163分子的细胞组与空载体转染组收获的子代病毒滴度差异不明显，这与在外周血单核细胞上的试验结果不一致。本研究结果提示，PRRSV存在其他决定病毒复制的受体。

综上，猪肺泡巨噬细胞和猪子宫内膜内皮细胞均为PRRSV的宿主细胞，猪肺泡巨噬细胞中重要的病毒受体CD163分子，不仅在猪子宫内膜内皮细胞中不表达，而且在PRRSV感染猪子宫内膜内皮细胞的过程中无明显作用。PRRSV感染猪子宫内膜内皮细胞与猪肺泡巨噬细胞的机制不同，需进一步探索PRRSV的病毒受体。

[1] Stevenson G W,Alstine W G V,Kanitz C L.Characterization of infection with endemic porcine reproductive and respiratory syndrome virus in a swine herd[J].Journal of the American Veterinary Medical Association,1994,204(12):1938-1942.

[2] Christianson W T,Choi C S,Collins J E J,etal.Pathogenesis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection in mid-gestation sows and fetuses [J].Canadian Journal of Veterinary Research,1993,57(4):262-268.

[3] Keffaber K K.Reproductive failure of unknown etiology[J].Am Assoc Swine Pract Newsl,1989,1:1-9.

[4] Neumann E J,Kliebenstein J B,Johnson C D J,etal.Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome on swine production in the United States[J].Journal of the American Veterinary Medical Association,2005,227(3):385-392.

[5] 郭宝清,陈章水,刘文兴,等.从疑似PRRS流产胎儿分离PRRSV的研究[J].中国畜禽传染病,1996(2):1-4.

[6] Chen N,Cao Z,Yu X,etal.Emergence of novel European genotype porcine reproductive and respiratory syndrome virus in mainland China[J].Journal of General Virology,2011,92(4):880-892.

[7] 王小敏,何孔旺,张文文,等.2008—2010年中国华东地区PRRSV ORF5基因遗传变异分析[J].中国农业科学,2011,44(18):3886-3894.

[8] 王林建,郭振华,乔松林,等.河南地区NADC30-like PRRSV毒株的增殖特性与遗传进化分析[J].河南农业科学,2017,46(3):122-128.

[9] 崔丹丹,王傲杰,王新港,等.1株PRRSV类NADC30毒株的分离鉴定及序列分析[J].河南农业科学,2017,46(9):132-138.

[10] 李海琴,林娟,刘垒,等.2013年—2014年江西地区PRRSV分离株NSP2及ORF5基因的遗传变异分析[J].中国畜牧兽医,2015,42(9):2254-2261.

[11] 郭天准，常洪涛，崔丹丹，等.2014—2015年河南地区PRRSV的分子检测及NSP2、ORF5基因变异分析[J].病毒学报,2016,32(3):298-307.

[12] 焦文强,白献晓,徐引弟,等.华北地区猪繁殖与呼吸综合征病毒变异分析[J].河南农业科学,2017,46(10):128-131.

[13] 孟帆,姚敬明,吴忻,等.猪群暴发猪瘟与蓝耳病混合感染的诊断与防制[J].山西农业科学,2010,38(6):66-68.

[14] Rossow K D,Benfield D A,Goyal S M J,etal.Chronological immunohistochemical detection and localization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in gnotobiotic pigs[J].Vet Pathol,1996,33(5):551-556.

[15] Van B W,Delputte P L,Van G H J,etal.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus entry into the porcine macrophage[J].Journal of General Virology,2010,91(7):1659-1667.

[16] Zhang Q,Yoo D.PRRS virus receptors and their role for pathogenesis[J].Veterinary Microbiology,2015,177(3/4):229-241.

[17] Delrue I,Van G H,Van D J J,etal.Susceptible cell lines for the production of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by stable transfection of sialoadhesin and CD163[J].BMC Biotechnology,2010,10(1):48.doi:10.1186/1472-6750-10-48.

[18] Van G H,Van B W,Delputte P L J,etal.Sialoadhesin and CD163 join forces during entry of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].Journal of General Virology,2008,89(12):2943-2949.

[19] Welch S K,Calvert J G.A brief review of CD163 and its role in PRRSV infection[J].Virus Research,2010,154(1/2):98-103.

[20] Calvert J G,Slade D E,Shields S L J,etal.CD163 expression confers susceptibility to porcine reproductive and respiratory syndrome viruses[J].Journal of Virology,2007,81(14):7371-7379.

[21] 李秀媛,孙怀昌,宋红芹,等.猪CD163的分子克隆、原核表达及免疫血清制备[J].扬州大学学报(农业与生命科学版),2011,32(2):6-10.

[22] 徐雷,冯若飞,马忠仁.病毒受体研究进展[J].动物医学进展,2015,36(2):88-92.

[23] Weingartl H M,Sabara M,Pasick J,etal.Continuous porcine cell lines developed from alveolar macrophages:Partial characterization and virus susceptibility[J].Journal of Virological Methods,2002,104(2):203-216.

[24] Yoojin L,Choikyu P,Eeuri N,etal.Generation of a porcine alveolar macrophage cell line for the growth of porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].Journal of Virological Methods,2010,163(2):410-415.

[25] Feng L,Zhang X,Xia X,etal.Generation and characterization of a porcine endometrial endothelial cell line susceptible to porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].Virus Research,2013,171(1):209-215.

[26] Wang L,Zhang H,Xiong S,etal.Increase of CD163 but not sialoadhesin on cultured peripheral blood monocytes is coordinated with enhanced susceptibility to porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection[J].Veterinary Immunology & Immunopathology,2011,141(3/4):209-220.