宋 扬，郝建军，王树桐，胡同乐，王亚南，王晓燕，曹克强*

(1.河北农业大学 植物保护学院，河北 保定 071001； 2.缅因大学 食品与农业学院，缅因州 奥罗诺 04473；3.河北农业大学 生命学院，河北 保定 071001)

据联合国粮农组织(FAO)统计，目前世界马铃薯年平均种植面积高达1 920万hm2，鲜薯的年总产量达3.9亿t。而中国马铃薯种植面积为557.3万hm2，占世界总种植面积的1/4。继2015年我国提出了马铃薯主粮化战略以来，马铃薯的生产越来越受到民众和外界的关注，未来将成为我国主要粮食作物之一[1]。马铃薯黑胫病是世界马铃薯种植中的重要病害[2]，近些年在我国发生越来越严重[3]，威胁着马铃薯产业的健康发展。

马铃薯黑胫病是由果胶杆菌(Pectobacteriumspp.)和Dickeyaspp.引起的发生在马铃薯植株茎基部及块茎上的严重病害，该病害主要侵染维管束组织，从种薯发芽到生长后期均可发病，以苗期最盛[4]。病害主要通过带病种薯和土壤进行传播扩散，病原菌因隐藏在植物的皮孔及木栓化组织中，很难被杀死，且繁殖传播速度快。目前，生产上对该病害的防治以预防为主[5]，选育和种植马铃薯抗性品种是有效防治方法之一。虽然我国目前种植的马铃薯品种繁多，但抗马铃薯黑胫病的品种匮乏，抗性品种多来自于国外引种[6]。为了实现马铃薯的安全生产，河北农业大学与美国缅因大学开展了合作研究，通过对来自美国的24个马铃薯种质材料进行人工接种病原菌，在室内离体与温室盆栽条件下分别测定不同马铃薯品种的抗病等级，对其进行抗黑胫病评价，旨在筛选出具有良好抗性的材料，为更好地防控黑胫病奠定基础，也为我国马铃薯的抗性引种和育种提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 供试病原菌

马铃薯黑胫病病原菌DickeyadianthicolaME30、PectobacteriumwasabiaeWPP163由美国缅因大学Hao’s Lab 提供。

1.2 供试马铃薯品种

包括Rideau、Nordak、Pioneer、Norland、Stately、Norcheif、Rosegold、Norvalley、Super Red Norland、Warba、Nordonna、Atlantic、Sebago、Rural New Yorker、Red Warba、White Cloud、Reba、Satapa、Wasca、Pantonac、Red Burt、Ranger Russet、Norglean和Sangre。24个马铃薯品种均由美国缅因大学提供，保存于缅因大学冷藏室中备用。

1.3 供试试剂

TSA(tryptic soy agar)培养基、TSB(tryptic soy broth)培养基、0.6%的次氯酸钠等所有试剂均购自美国SIGMA-ALORICH公司。

1.4 试验方法

1.4.1 菌悬液的制备 将由-80 ℃超低温冰箱中取出的ME30、WPP163，于28 ℃条件下在TSA培养基上复壮48 h。挑取菌株单菌落于100 mL 高温灭菌过的TSB培养基中，摇培24 h，设置摇培条件：180 r/min、28 ℃。用平板计数法调节菌悬液浓度至108cfu/mL。

1.4.2 离体条件下马铃薯品种的抗性测定

1.4.2.1 马铃薯整薯的接种 挑取无病马铃薯，经0.6%的次氯酸钠溶液消毒5 min，用清水冲洗后备用。在马铃薯两端选取适当位置(两位置之间间隔大于3 cm)，用灭菌的1 mL枪头在马铃薯上造成1.5 cm深的伤口，接入50 μL的菌悬液，贴上标签纸。试验设置2种病原菌，24个马铃薯品种，每个处理设置3次重复，以无菌水为对照。将浸水的湿纸巾铺于已灭菌的容器底部，放置带孔隔板，将马铃薯置于隔板之上，盖上容器的盖子以维持湿度。于28 ℃黑暗环境下培养5 d后检查发病情况[7]。

1.4.2.2 离体条件下马铃薯发病情况的调查 沿接种的孔隙纵向切开，在纵切面上测量接种点以下腐烂区域的深度及宽度，以深度与宽度的乘积模拟腐烂区域纵切面面积，表示腐烂程度。参照Lapwood等[7]的方法并做改进，对不同品种进行抗性分级，分级标准如下：腐烂程度(深度×宽度)数值为0～1的马铃薯品种的抗病类型为高抗(HR)；1～2的品种为抗(R)；2～3的品种为中抗(MR)；3～4的品种为中感(MS)；≥4的品种为感病(S)。

1.4.3 温室条件下马铃薯品种的抗性测定

1.4.3.1 试验温室条件概况 试验在美国缅因大学植病流行与综合防治试验温室中进行，常年湿度在70%左右，温度控制在20 ℃左右。马铃薯实施盆栽，种植在容积4 L的盆中，光照条件为16 h光照、8 h黑暗，所使用土壤(Kids b kids)购自美国沃尔玛超市。

1.4.3.2 病原菌的接种 将带芽的无病马铃薯切成两半，伤口在超净台中愈合48 h后种植于无菌培养土中。种植1周后开始灌溉，采用喷灌，每3 d一次。种植25～30 d时，于马铃薯植株茎基部15～20 cm处接种10 μL 106cfu/mL的菌悬液[8]。试验设置2种病原菌，24个马铃薯品种，每个处理设置4个重复，以注射无菌水作为对照，采用随机区组排列盆栽。

1.4.3.3 病害的调查 接种病原菌16 d后进行病害调查。以接种点为中心，调查上下各5 cm范围内发病面积。按照以下评级方法对马铃薯的抗性进行评价：调查范围内无病害发生，抗病等级为0；发病面积占调查面积25%以下，抗病等级为1；发病面积占调查面积25%～50%，抗病等级为2；发病面积占调查面积50%～75%，抗病等级为3；发病面积占调查面积75%～100%，抗病等级为4。当0≤抗病等级平均值<1时，抗病类型为高抗(HR)；当1≤抗病等级平均值<2时，抗病类型为抗(R)；当2≤抗病等级平均值<3时，抗病类型为中抗(MR)；当3≤抗病等级平均值<4时，抗病类型为中感(MS)；当抗病等级平均值=4时，抗病类型为感(S)。

2 结果与分析

2.1 离体条件下马铃薯品种对P.wasabiae WPP163的抗性评价

对人为制造伤口、接种病原菌WPP163后的马铃薯进行发病情况调查，结果见表1。表现抗性(R)的品种有Sangre、Norglean、Ranger Russet、Red Burt 4份，腐烂程度分别为1.11、1.30、1.36、1.59，占所测试马铃薯品种的16.67%；表现为中抗(MR)的马铃薯品种有Pantonac、Wasca、Satapa、Reba、White Cloud、Red Warba、Rural New Yorker、Sebago、Atlantic 9份，占测试总品种数的37.5%；表现为中感(MS)的马铃薯品种有Nordonna、Warba、Super Red Norland、Norvalley、Rosegold、Norcheif 6份，占到了供试材料的25%；而感病(S)的品种为Stately、Norland、Pioneer、Nordak、Rideau 5份，占供试马铃薯品种的20.83%。

表1 室内离体条件下不同马铃薯品种对P.wasabiae WPP163的抗性评价

注：数据后不同小写英文字母表示在0.05水平上差异显著(Duncan氏新复极差法)，下同。

2.2 离体条件下马铃薯品种对D.dianthicola ME30的抗性评价

从表2可以看出，对病原菌ME30表现高抗(HR)的品种有1份，为Ranger Russet，腐烂程度为0.81，占供试马铃薯材料的4.17%；表现为抗性(R)的品种有Wasca、Satapa、Pantonac、Sangre 4份，腐烂程度分别为1.16、1.59、1.81、1.96，占测试马铃薯品种总数的16.67%；表现为中抗(MR)的品种有Red Warba、Sebago、Norcheif、Super Red Norland、Stately、Rural New Yorker 6份，所占比例为25%；而表现为中感(MS)的马铃薯品种有Norvalley、Norglean、Norland、Warba、White Cloud、Red Burt、Nordak、Rosegold 8份，占总数的33.33%；表现为感病(S)的品种有Rideau、Atlantic、Nordonna、Pioneer、Reba 5份，占总数的20.83%。

表2 室内离体条件下不同马铃薯品种对D.dianthicola ME30的抗性评价

2.3 温室盆栽条件下马铃薯品种对P.wasabiae WPP163的抗性评价

温室活体条件下，利用注射法接种病原菌WPP163，待马铃薯发病后调查病害的严重程度，结果如表3所示。24个测试品种中，Ranger Russet、Sangre、Norglean较抗病，平均抗病等级分别为1.0、1.3、1.3；Wasca、Pantonac、Red Burt、Satapa、Reba、White Cloud、Red Warba具有一定的抗病性，平均抗病等级分别为2.0、2.0、2.3、2.3、2.3、2.7、2.7。供试的马铃薯品种中，具抗性的品种占41.67%，其余为中感与感病品种。接种马铃薯黑胫病菌WPP163后，品种Sangre、Norglean、Ranger Russet无论在离体或温室活体条件下都表现出良好抗性。

表3 温室活体条件下不同马铃薯品种对P.wasabiae WPP163的抗性评价

2.4 温室盆栽条件下马铃薯品种对D.dianthicola ME30的抗性评价

从表4可以看出，对病原菌ME30表现为高抗的马铃薯品种有1份，为Ranger Russet，平均抗病等级为0.7；Wasca、Satapa、Sangre表现为抗病，平均抗病等级分别为1.0、1.7、1.7；具有中度抗性的马铃薯品种为Pantonac、Red Warba、Sebago、Norcheif、Rural New Yorker，平均抗病等级分别为2.0、2.3、2.3、2.7、2.7。具抗性的马铃薯品种共有9份，占供试品种的37.5%，中感与感病品种共占到供试品种的62.5%。24个品种中，Sangre、Satapa、Wasca、Ranger Russet在活体与离体条件下对病原菌ME30都表现出良好抗性。

表4 温室活体条件下不同马铃薯品种对D.dianthicola ME30的抗性评价

续表4 温室活体条件下不同马铃薯品种对D.dianthicola ME30的抗性评价

3 结论与讨论

采用人工接种的方法，可在室内创造病害发生发展的条件，完成对抗马铃薯黑胫病品种的筛选与科学评价，快速高效，有助于为马铃薯的抗病育种提供亲本材料。本试验中所用的改进自Lapwood等[7]的新抗性评价方法，同时测量了腐烂区域的宽度与深度，因腐烂区域是一个立体图形，所以这种评价方式比仅测量宽度的方法更客观。以深度与宽度的乘积表示腐烂程度，省去了原方法中称量马铃薯质量的步骤，更加省时高效。利用改进后的方法对24份品种进行筛选，获得了在室内离体条件下对DickeyadianthicolaME30、PectobacteriumwasabiaeWPP163 2种病原菌均有良好抗性的马铃薯品种Ranger Russet和Sangre，为后期抗性品种的田间评价提供了理论依据[9]。

欧美国家在马铃薯黑胫病方面的研究开展较早，且特别重视对于抗病品种的鉴定与搜集，因此，由国外引进的马铃薯品种其抗性往往高于目前国内所种植的品种[10]。本试验通过对24份由美国缅因大学提供的马铃薯品种进行抗性评价，筛选出了在室内离体条件与温室活体条件下，对病原菌P.wasabiaeWPP163具有良好抗性的马铃薯品种Sangre、Norglean、Ranger Russet，对病原菌D.dianthicolaME30具有良好抗性的马铃薯品种Ranger Russet、Wasca、Satapa、Sangre，其中Ranger Russet和Sangre对2种病原菌均有良好抗性，这不仅对马铃薯的安全生产具有指导意义，而且也为我国马铃薯抗性材料的引种和抗性育种提供了可靠材料和理论依据。

[1] Hermansen A,Lu D,Forbes G.Potato production in China and Norway: Similarities differences and future challenges[J].Potato Research,2012,55(3/4):197-203.

[2] Toth I,Van Der Wolf J,Saddler G,etal.Dickeyaspecies: An emerging problem for potato production in Europe[J].Plant Pathology,2011,60(3):385-399.

[3] 李建军,刘世海,惠娜娜,等.马铃薯黑胫病田间防治药剂筛选[J].植物保护,2010,36(4):181-183.

[4] Slawiak M,Van Beckhoven J R C M,Speksnijder A G C,etal.Biochemical and genetical analysis reveal a new clade of biovar 3Dickeyaspp.strains isolated from potato in Europe[J].European Journal of Plant Pathology,2009,125(2):245-261.

[5] Wyatt G,Lund B.The effect of antibacterial products on bacterial soft rot of potatoes[J].Potato Research,1981,24(3):315-329.

[6] 王立春,盛万民,朱杰华,等.马铃薯品种黑胫病抗性筛选与评价[J].黑龙江农业科学,2012(11):5-7.

[7] Lapwood D H,Read P J,Jams S,etal.Methods for assessing the susceptibility of potato tubers of different cultivars to rotting byErwiniacarotovorasubspeciesatrosepticaandcarotovora[J].Plant Pathology,1984,33(1):13-20.

[8] 方中达.植病研究方法[M].3版.北京:中国农业出版社,1998.

[9] 孟令文,安颖蔚,宋红叶,等.马铃薯抗病育种研究进展[J].杂粮作物,2006,26(3):185-186.

[10] Douches D S,Maas D,Jastrzebski K,etal.Assessment of potato breeding progress in the USA over the last century[J].Crop Science,1996,36(6):1544-1552.