李 欢,曹雪梅,陈 茹,贾 杰,马桂珍,暴增海*

(1.淮海工学院 海洋学院，江苏 连云港 222005； 2.江苏耕耘化学有限公司，江苏 连云港 222005)

黄瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌黄瓜专化型引起的植物土传病害[1]，在露地和保护地栽培的黄瓜上均可发生，连作地区病情尤为严重，发病率一般为10%～30%，严重时可达80%～90%[2]。防治黄瓜枯萎病最为常见的方法是使用化学农药，包括多菌灵、菌毒清、恶霉灵、代森锰锌等杀菌剂[3]。然而长期使用化学药剂不仅易造成环境污染、农药残留等问题，而且随着化学药剂的不断使用，病菌易产生抗药性。因此，寻求安全有效防治黄瓜枯萎病的方法是目前植保领域主要的研究方向之一。

生物防治因其安全、高效、不污染环境，在植物病害防治中显示出良好的优势及应用前景，其中芽孢杆菌属和假单胞菌属的细菌研究较多[4]。Chung等[5]发现了枯草芽孢杆菌ME488具有广谱抗菌性，且能够抑制黄瓜枯萎病的发生。李晶等[6]在黄瓜根围土中分离得到一株枯草芽孢杆菌B29菌株，该菌株对黄瓜枯萎病的田间防效高达84.9%，且对黄瓜具有增产作用，增产效果为12.57%。苗则彦等[7]分离出一株黄瓜内生枯草芽孢杆菌B504菌株，该菌株对黄瓜枯萎病菌的生长抑制率达44.1%。王灿华等[8]从植物根际土壤中分离出一株假单胞菌M18菌株，该菌株与植物根系存在互利共生关系，可大量生存在植物根际周围，形成一种生物屏障，从而抑制土传病原菌的生长并阻止病原菌侵入植物体内；以M18活菌浸种处理黄瓜种子并在大棚定植后灌根处理黄瓜幼苗，可使黄瓜枯萎病的发病率降低70%～80%，并使黄瓜产量提高20%。

多黏类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)作为生防菌的一个重要组分，对小麦赤霉病[9]、番茄青枯病[10]、木麻黄青枯病[11]等多种植物病害均有一定的防治效果。曹利亚等[12]还发现，多黏类芽孢杆菌HT16对梨黑斑病菌有较强的抑制作用，其体外抑制率为53.2%，能显著抑制梨采后黑斑病的发生。由华东理工大学与上海泽元海洋生物技术有限公司联合创制的多黏类芽孢杆菌可湿性粉剂(登记证号：PD20140273)对番茄青枯病、西瓜枯萎病、黄瓜角斑病和西瓜炭疽病都有明显的防治作用，已经实现工业化生产及应用[13]。

海洋多黏类芽孢杆菌具有耐盐和产生不同于陆源微生物代谢产物的特点，可以作为盐碱地防治土传病害生物农药的最佳选择。马桂珍等[14]从连云港海域海泥中分离得到1株多黏类芽孢杆菌L1-9菌株，该菌株对多种植物病原真菌和细菌有较好的抑制作用，并且能够产生几丁质酶、葡聚糖酶、蛋白酶和纤维素酶等细胞壁水解酶和抗菌蛋白[15]，具有一定的开发潜力。本试验以L1-9菌株粉剂为研究对象，测定其对黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumsp.cucumebriumOwen)、大豆菌核病菌(Sclerotinasclerotiorum)、水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)、菠菜早疫病菌(Alternariasolani)4种植物病原真菌的毒力，并探讨其对黄瓜枯萎病的防治作用和对黄瓜生长的促进作用，为海洋多黏类芽孢杆菌菌剂的研究提供参考依据，也为生物农药的研发增加一个新的素材。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试粉剂 多黏类芽孢杆菌L1-9菌株粉剂自制，含菌量为2.4×1010cfu/g。

1.1.2 植物病原菌 黄瓜枯萎病菌、大豆菌核病菌、水稻纹枯病菌、菠菜早疫病菌由中国农业科学院植物保护所提供。

1.1.3 培养基 病原真菌活化及抑菌试验用培养基为PDA 培养基；黄瓜枯萎病菌扩繁培养基为麦粒砂培养基：麦粒40 g、水60 mL、砂100 g，pH值自然。

1.1.4 黄瓜种子 品种为金盛达四号，由南京金盛达种子有限公司生产，购于连云港市农业科学院种子中心。

1.1.5 土壤 供试土壤为连云港市东辛农场菜园土，取回除杂后121 ℃高压蒸汽灭菌2 h，备用。

1.2 试验方法

1.2.1 海洋细菌L1-9菌株粉剂对4种植物病原真菌的毒力测定 采用含药平板法，将不同质量的L1-9菌株菌剂加入到装有70 mL PDA培养基的250 mL的三角瓶中，混合均匀，制成浓度不同的含药平板，每个三角瓶为一个浓度，平均倒入3个培养皿中，为3个重复，以不加粉剂为对照。取直径为5 mm的供试黄瓜枯萎病菌、大豆菌核病菌、水稻纹枯病菌、菠菜早疫病菌4种植物病原真菌菌苔于不同浓度的含药平板中央，28 ℃下培养5 d。采用十字交叉法测量植物病原真菌菌落直径，计算抑制率，查询抑制率概率值，以粉剂质量浓度的对数为横坐标，抑制率的概率值为纵坐标，建立L1-9菌株粉剂对4种植物病原真菌的毒力回归方程，计算半数有效质量浓度(EC50)和90%有效质量浓度(EC90)。

1.2.2 不同用药方法对黄瓜幼苗的促生防病效果测定 将直径9 mm的黄瓜枯萎病菌菌苔接种到黄瓜枯萎病菌扩繁培养基中，28 ℃恒温培养5 d。取出扩繁后的黄瓜枯萎病菌培养物加入土壤中，混匀制成菌含量为3%的含菌土壤。

设拌种法、拌土法、灌根法3种施药方法。拌种法：取黄瓜种子质量3%的菌株粉剂对黄瓜种子进行拌种后催芽，接种到已制备好的含菌土壤中；拌土法：制备质量分数为30%的含药土壤，将已催芽的黄瓜种子接种到制备好的黄瓜枯萎病菌土壤中，在黄瓜种子上下各铺一层含药土壤；灌根法：将催芽后的黄瓜种子播种在装有黄瓜枯萎病菌土壤的塑料杯中，待黄瓜长到子叶期时，用20%的菌株粉剂溶液进行灌根处理。每个方法处理10盆，每盆3株，播种后正常管理，不施用农药和化肥，以不施用菌株粉剂的黄瓜为对照(CK)。

黄瓜幼苗生长至三叶期时，测定幼苗的株高、茎粗、地上和地下部鲜质量以及须根数，调查发病率和病情指数，计算防病效果。

2 结果与分析

2.1 L1-9菌株粉剂对4种病原真菌的毒力

分别将0.1、0.25、0.5、0.75、1、2、4 g的L1-9菌株粉剂加入到装有70 mL PDA的三角瓶中，混合均匀，制成不同浓度的含药平板，用于测定L1-9菌株粉剂对大豆菌核病菌的毒力；分别将0.05、0.1、0.25、0.5、0.75、1、2 g的L1-9菌株粉剂加入到装有70 mL PDA的三角瓶中，混合均匀，制成不同浓度的含药平板，用于测定L1-9菌株粉剂对黄瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌、菠菜早疫病菌的毒力。L1-9菌株粉剂对4种植物病原菌的毒力回归方程见表1。

表1 L1-9菌株粉剂对4种病原真菌的毒力测定结果

从表1可以看出，L1-9菌株粉剂对4种病原真菌生长均具有一定的抑制作用，其对4种病原真菌的EC50大小顺序为：大豆菌核病菌(53.689 5 mg/L)>水稻纹枯病菌(50.811 3 mg/L)>黄瓜枯萎病菌(48.925 2 mg/L)>菠菜早疫病菌(38.312 2 mg/L)。L1-9菌株粉剂对4种病原真菌的EC90大小顺序同样为：大豆菌核病菌(95.893 5 mg/L)>水稻纹枯病菌(90.231 3 mg/L)>黄瓜枯萎病菌(86.713 2 mg/L)>菠菜早疫病菌(66.732 2 mg/L)。结果表明，L1-9菌株粉剂对菠菜早疫病菌的抑制作用最强，对黄瓜枯萎病菌的抑制作用次之，对大豆菌核病菌、水稻纹枯病菌的抑制作用较差。

2.2 L1-9菌株粉剂对黄瓜生长的促进作用

从表2可以看出，采用3种不同的用药方法，L1-9菌株粉剂对黄瓜生长均具有明显的促进作用。不同用药方法处理后，黄瓜地上部分鲜质量的增加最为明显，其中采用拌土法处理的黄瓜幼苗地上部分鲜质量增加最多，比CK增加了243.75%，采用拌种法处理后地上部分鲜质量比CK增加了215.79%，灌根处理后地上部分鲜质量增加了184.09%。3种用药方法处理后黄瓜幼苗地下部分鲜质量的增加量也都超过了50%。拌种和拌土处理后黄瓜幼苗的须根数分别增加了113.11%和101.61%，灌根处理后的须根数也增加了81.67%，但灌根用药对黄瓜的株高和茎粗没有促进作用。

2.3 L1-9菌株粉剂对黄瓜枯萎病的防治作用

从表3可以看出，L1-9菌株粉剂不同用药方法对黄瓜枯萎病均具有较强的防治作用。未用菌株粉剂处理的黄瓜发病率均为70%以上，病情指数也达到45以上，用L1-9菌株粉剂处理后黄瓜发病率降低到35%以下，病情指数也降低到10左右。3种用药方法对黄瓜枯萎病的防治效果均在75%以上，其中拌土处理的防治效果最高，为81.32%，其次为灌根处理，防治效果为78.75%，拌种处理的防治效果也达到了77.12%。结果表明，L1-9菌株粉剂对黄瓜枯萎病具有明显的防治作用，其最适的用药方法为拌土法。

表2 L1-9菌株粉剂不同用药方法对黄瓜生长的影响

表3 L1-9菌株粉剂不同用药方法对黄瓜枯萎病的防治效果

3 结论与讨论

L1-9菌株粉剂对4种植物病原菌的毒力测定结果表明，其对黄瓜枯萎病菌、大豆菌核病菌、水稻纹枯病菌、菠菜早疫病菌均有一定的抑制作用。王希等[16]对L1-9菌株发酵液的研究显示，其对黄瓜的防病效果为64.71%，而本试验中L1-9菌株粉剂的防病效果在75%以上，较发酵液的防病效果明显增加，推测可能与用药方式和菌含量的不同有关。这为其开发利用提供了参考依据。

近年来，有关防治植物病害的微生物制剂的研究报道日益增加。康萍芝等[17]研究的哈茨木霉制剂对设施连作番茄枯萎病的防治效果在75%以上，且对番茄的生长具有促进作用，能够明显改善番茄根际土壤微生态环境。何斐等[18]研究的生防链孢霉菌Act11和Act12菌剂对魔芋软腐病有良好的防病作用，其相对防效在65%以上。秦娟娟等[19]研究了植物内生细菌固体菌剂对辣椒的促生防病作用，其中对辣椒疫霉病的防治效果为75.0%～84.2%，与本试验中L1-9菌株粉剂对黄瓜枯萎病的防治效果相当。

微生物制剂配合施用的研究也日益增多[20]。甘良等[21]、张忠良等[22]、申光辉等[23]分别研究了放线菌混合制剂对西瓜的防病促生作用、放线菌与有机钾肥腐植酸钾配施对魔芋的防病促生作用、密旋链霉菌与硅酸钾配施对草莓的防病促生作用，结果显示，放线菌混合制剂施用对植株的防病效果和放线菌与钾肥的配合施用对植株的防病效果都优于单独菌株，能够更好地发挥其生防效果。李广记等[24]通过研究木霉菌菌剂、枯草芽孢杆菌菌剂和混合菌剂对水稻纹枯病病情指数的影响，发现单一微生物菌剂的处理效果优于混合菌剂处理。这2种不同结果可能与试验菌剂不同有关。本研究中，防治黄瓜枯萎病所采用的L1-9菌株粉剂为单一微生物制剂，其与其他菌剂或肥料配合施用是否具有增效作用有待进一步研究。

微生物制剂的使用方法不同，其防治效果也会有所不同。李广记等[24]探讨了不同菌剂的最适用药方式，发现菌剂不同，其最适的用药方式也不同。木霉菌菌剂适合拌土使用，枯草芽孢杆菌菌剂适合多种用药方法联合使用，混合菌剂适合拌土+蘸根联合使用。本试验也研究了L1-9菌株粉剂不同用药方法对黄瓜的促生防病效果，结果同样显示，用药方式不同，促生防病效果有所差别，L1-9菌株粉剂最适的用药方法为拌土法。

此次防病研究采用的是室内盆栽试验，然而将菌剂大规模应用于田间时，防病效果会受到土壤、降雨量、温湿度等因素的影响[25]，因此，L1-9菌株粉剂的大田防效及其稳定性还有待进一步研究。

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