朱素琴，马 红，田 洋，尹文娟，许浣文，周 毅，杨 平

(1.南通大学 生命科学学院，江苏 南通 226019； 2.南通大学/农业部南方平原玉米科学观测实验站，江苏 南通 226019)

L-半乳糖途径是植物合成AsA的主要途径[4]，其过程简示如下：D-葡萄糖→D-甘露糖-1-P→GDP-D-甘露糖→GDP-L-半乳糖→L-半乳糖-1-P→L-半乳糖→ L-半乳糖酸-1,4-内酯→ L-抗坏血酸。此途径中的一个关键酶是L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶(L-galactono-1,4-lactone dehydrogenase,GLDH)，该酶催化L-半乳糖酸-1,4-内酯产生AsA。GLDH在植物体中以单体形态存在，对L-半乳糖酸-1,4-内酯有很高的特异性，定位于线粒体内膜[5]。在转反义GLDH基因的烟草中，AsA含量很低。GLDH基因的表达受光诱导，并调节植物体中的AsA含量[6]。

玉米(ZeamaysL.)是全球种植面积最大的粮食作物之一，中国是世界上第二大玉米生产国。玉米在生长发育过程中，不可避免地会遭遇干旱、高盐、低温等极端生长环境，这些非生物胁迫因素严重影响了玉米的生长发育，导致减产，甚至颗粒无收。玉米GLDH是玉米AsA合成途径中的关键酶，影响玉米AsA含量，进而影响玉米细胞的氧化还原状态，最终影响玉米的抗逆能力。玉米基因组中有1个GLDH基因(LOC 100381436)，有关ZmGLDH基因在玉米生长发育，特别是在干旱、高盐逆境中的作用尚未见报道，鉴于此，根据MaizeGDB(http://www.maizesequence.org) 提供的序列设计引物，克隆得到玉米ZmGLDH基因，同时研究了盐胁迫对ZmGLDH基因表达的影响，分析了盐胁迫处理后玉米叶片中AsA含量的变化，为进一步研究该基因在玉米生长发育和抗逆反应中的作用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

以大面积种植的郑单958为试验材料。将种子暴晒1 d后，选取健壮饱满的种子，用多菌灵浸泡1 h，去离子水充分漂洗后浸泡20 h，再将玉米种子均匀排列在垫有2层滤纸的培养皿中，每皿100粒种子，于黑暗条件下30 ℃催芽，待胚根长至2～3 cm时，挑选长势良好的发芽种子置于霍格兰营养液中进行溶液培养。培养温度为30 ℃/25 ℃(昼/夜)，相对湿度为65%～70%，光子通量密度(photon flux density,PFD)为600 μmol/(m2·s)，培养玉米幼苗至三叶期。

将三叶期的玉米置于含有200 mmol/L NaCl的霍格兰培养液中进行处理，分别于处理后0(对照，CK)、0.5、1、2、3、4 h取材，进行AsA含量测定和ZmGLDH基因表达分析。

1.2 菌株、载体及生化试剂

大肠杆菌菌株为DH5α，由南通大学生命科学学院实验室保存。RNA提取试剂盒购自QIAGEN公司，限制性内切酶、卡那霉素(Kanamycin)购自TaKaRa公司，KOD-Plus-Ver.2、pTA2 载体、ReverTra Ace qPCR RT Kit购自TOYOBO公司，DNA凝胶回收试剂盒、质粒快速提取试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司，Trans DNA Marker Ⅳ、Trans Blue Plus protein Marker购自全式金生物技术公司。PCR引物合成、DNA测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。克隆ZmGLDH基因所用引物序列为F：5′-TGCCGTCGCCGTCCATC-3′；R：5′-CCAGGGTAGGGTCCCAGAATC-3′。

1.3 ZmGLDH基因的克隆

根据玉米ZmGLDH基因序列(LOC 100381436)设计引物，以郑单958为试验材料，采用RT-PCR技术扩增ZmGLDH基因。PCR产物连接 pTA2 载体，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，涂布于含氨苄青霉素(Amp)的LB平板，37 ℃培养14～16 h，进行菌落PCR筛选。挑取阳性菌落于含Amp的LB培养基中，37 ℃、200 r/min振荡培养14 h，提取质粒，进行酶切鉴定，阳性菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.4 实时荧光定量PCR分析

采用TOYOBO公司的SYBR Green RT-PCR One Step Kit及ABI 7500 Real time PCR仪进行实时荧光定量PCR分析。每个样品进行3次重复检测，Zmβ-actin作为内参基因。ZmGLDH基因荧光定量PCR引物序列为：5′-GTCCATTCGGGAGCAGCAGGT-3′/5′-CCAAGTCCACAGCGAGCAAGATA-3′，Zmβ-actin内参基因的引物序列为：5′-GGGACCTGACTGACTACCTC-3′/5′-TCATACTCCTGCTTGCTGAT-3′。按相对定量法计算目的基因相对表达量Rel.Exp=2-△△Ct，其中，△△Ct=(待测样品目的基因的Ct-待测样品内参基因的Ct)-(对照样品目的基因的Ct-对照样品内参基因的Ct)[7]。

1.5 AsA提取与含量测定

AsA的提取与含量测定按照张志良等[8]方法。AsA可以把铁离子还原成亚铁离子，亚铁离子与红菲咯啉(4,7-二苯基-1,10-菲咯啉，BP)反应，形成红色螯合物，在534 nm波长下有最大吸收峰，用比色法测定。

2 结果与分析

2.1 ZmGLDH基因的克隆

2.1.1 玉米总RNA的提取 采用QIAGEN公司的RNeasy Plant Mini试剂盒提取玉米叶片总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测所提取的RNA。从图1可以看到清晰的2条带，分别是28S、18S的电泳条带，28S条带的亮度约为18S条带的2倍，说明提取的RNA比较完整。同时，用分光光度计测定了所提RNA的浓度和纯度，6个样本RNA的OD260/OD280值均在1.9～2.0，表明所提RNA质量符合克隆和荧光定量PCR的试验要求。

泳道1、2、3、4、5、6分别表示三叶期玉米在经过200 mmol/L NaCl处理0、0.5、1、2、3、4 h后所提取到的叶片RNA图1 玉米叶片RNA的琼脂糖凝胶电泳结果

2.1.2ZmGLDH基因的克隆与GLDH分子结构分析 根据ZmGLDH基因序列(LOC 100381436)设计引物，采用RT-PCR技术扩增ZmGLDH基因cDNA片段，克隆全长ZmGLDH基因，重组质粒pTA2-ZmGLDH的酶切鉴定结果见图2。阳性菌落送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果比对分析显示，所测序列与MaizeGDB提供的序列一致。经GSDS在线软件分析，ZmGLDH基因有6个外显子、5个内含子，其全长cDNA序列包含一个1 761 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF)，编码586个氨基酸。

M.分子质量标记Trans 5k plus;1.EcoRⅠ酶切重组质粒pTA2-ZmGLDH图2 重组质粒pTA2-ZmGLDH的酶切鉴定结果

蛋白质氨基酸序列比对结果(图3)显示，玉米ZmGLDH(NP_001167748.1)与水稻OsGLDH(XP_015616655.1、XP_015619621.1)、高粱GLDH(XP_021317136.1)、谷子GLDH(XP_004977506.1)、拟南芥GLDH(NP_190376.1)的相似性分别为86%、86%、94%、94%、74%。根据UniProtKB/Swiss-Prot提供的分析结果，玉米ZmGLDH基因产物含586个氨基酸残基，第1—39位氨基酸肽段是转运肽，第40—81位氨基酸肽段是被去除的肽段，GLDH酶蛋白含有505个氨基酸残基(82—586位)。

TMpred-Prediction of Transmembrane Regions and Orientation预测ZmGLDH酶蛋白有3个跨膜肽段(图4)：第132—154位氨基酸(23个氨基酸)为第1个跨膜肽段，第245—267位氨基酸(23个氨基酸)为第2个跨膜肽段，第472—496位氨基酸(25个氨基酸)为第3个跨膜肽段。ZmGLDH酶蛋白的N-末端位于线粒体内膜内侧、C-末端位于内膜外侧。第1个和第3个跨膜肽段由线粒体内膜内侧朝向线粒体内膜外侧，第2个跨膜肽段由线粒体内膜外侧朝向线粒体内膜内侧。Conserved domain search预测ZmGLDH酶蛋白分子中第104—239位氨基酸(136个氨基酸)的肽段是结合FAD的结构域(图4中双线表示)。结构域中有28个氨基酸(第104—131位氨基酸)位于内膜内侧，23个氨基酸(第1个肽段，第132—154位氨基酸)横跨内膜，85个氨基酸(第155—239位氨基酸)位于内膜的外侧，因此，ZmGLDH酶蛋白结合FAD结构域主要位于内膜的外侧[9-10]，所以ZmGLDH酶蛋白是位于线粒体内膜外侧的膜结合酶。GLDH催化底物L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢生成AsA，同时，将高铁细胞色素C(Ferricytochrome C，氧化型)还原为亚铁细胞色素C(Ferrocytochrome C，还原型)。细胞色素C是呼吸链中介于复合体Ⅲ和复合体Ⅳ间且位于内膜外侧的重要电子传递体[11]。因此，AsA的从头合成途径与呼吸链的电子传递密切相关。

NP_001167748.1、XP_021317136.1、XP_004977506.1、NP_190376.1分别为玉米、高粱、谷子、拟南芥GLDH氨基酸序列登录号，XP_015616655.1、XP_015619621.1为水稻GLDH氨基酸序列登录号；氨基端灰色底纹大写字母：转运肽；带方框的字母：被去除的肽段；灰色底纹小写字母：跨膜肽段(跨膜方向和相关肽段由Tmpred-Prediction of Transmembrane Regions and Orientation预测)；有下划线的字母：结合FAD的结构域

图4 ZmGLDH与线粒体内膜的结合

2.2 盐胁迫下ZmGLDH基因的实时荧光定量PCR分析

2.2.1 荧光定量PCR扩增曲线和熔解曲线 分别提取对照及200 mmol/L NaCl处理0.5、1、2、3、4 h的玉米叶片总RNA，逆转录合成cDNA，进行实时荧光定量PCR检测。图5中2组曲线分别是几个样品中ZmGLDH基因和内参Zmβ-actin基因的荧光定量PCR扩增曲线。从图5可以看出，ZmGLDH基因和内参Zmβ-actin基因的扩增曲线基线稳定，拐点清楚，各扩增曲线平行性好，曲线指数期斜率比较大。图6是ZmGLDH基因和内参Zmβ-actin基因的熔解曲线。对PCR产物加热，随着温度的升高，双链逐渐解开，导致荧光信号强度逐渐下降，到达某一温度时，会导致大量的PCR产物解链，荧光信号值急剧下降。不同PCR产物其Tm值不同，因此，使其荧光信号发生迅速下降的温度也不同，据此可对PCR产物的特异性进行鉴定。用PCR产物熔解过程中荧光信号值的负一次导数对温度作图，得到单一熔解峰，说明扩增的特异性较好。

图5 ZmGLDH基因及内参基因Zmβ-actin的扩增曲线

图6 ZmGLDH基因及内参基因Zmβ-actin的熔解曲线

2.2.2 盐胁迫对ZmGLDH基因表达的影响 根据ZmGLDH基因序列(LOC 100381436)，利用NCBI-Primer软件设计扩增引物。采用荧光染料法在ABI 7500实时荧光定量PCR仪上进行RT-qPCR检测，Zmβ-actin看家基因作为内参标化玉米cDNA的量。从图7可以看出，经过高盐胁迫处理后，ZmGLDH基因的表达量上调。盐胁迫处理0.5 h，ZmGLDH基因的表达量略有增加，为对照的1.07倍；盐胁迫处理1 h，ZmGLDH基因的表达量继续增加，但上升幅度较小，为正常条件下的1.20倍；盐胁迫处理2 h，ZmGLDH基因表达量明显增加，为正常条件下的2.31倍，达到最高表达水平；盐胁迫处理3 h，ZmGLDH基因表达量略有下降，但仍高于对照组，为正常条件下的2.20倍；盐处理4 h，ZmGLDH基因表达量继续下降，为正常条件下的1.46倍。

图7 盐胁迫下玉米叶片中ZmGLDH基因的表达量变化

2.3 盐胁迫对玉米叶片中AsA含量的影响

2.3.1 AsA标准曲线的绘制 以不同质量浓度AsA的OD534值对其相应浓度作图，得到标准曲线(图8)。曲线回归方程为y=0.251 7x+0.104 7，y表示AsA溶液在534 nm处的吸光度值，x表示溶液中AsA的质量浓度(mg/L)。如图8所示，AsA标准曲线的相关性很好，R2=0.993 9。

2.3.2 盐胁迫下玉米叶片中AsA含量的变化 如图9所示，盐胁迫处理后，玉米叶片中AsA含量发生变化。在盐胁迫处理1 h内，玉米叶片中AsA的含量变化不明显，随着盐处理时间的延长，玉米叶片中AsA含量增加。在正常条件下，玉米叶内AsA含量为0.762 8 mg/g；盐处理2 h，玉米叶内AsA含量为1.481 7 mg/g，是对照的1.94倍；盐处理 3 h，玉米叶内AsA含量为1.781 7 mg/g，是对照的2.33倍；随着盐处理时间进一步延长，玉米叶中AsA含量降低，盐处理 4 h，玉米叶内AsA含量为0.765 7 mg/g，与对照基本相同。

图8 AsA的标准曲线

图9 盐胁迫下玉米叶片中AsA含量的变化

2.4 玉米叶片中AsA含量与ZmGLDH基因表达量的相关性分析

比较图7与图9可以看出，盐胁迫处理后玉米叶片中AsA含量的变化趋势与玉米叶内ZmGLDH基因的表达量变化趋势基本一致，即在盐处理初期ZmGLDH基因的表达量和AsA含量的变化均不明显；盐胁迫处理2 h，ZmGLDH基因表达量达到最大，玉米叶内AsA含量也明显增加；盐胁迫处理3 h，ZmGLDH基因表达量仍然很高，其叶内AsA含量也达到最大。进一步对ZmGLDH基因表达量与玉米叶内AsA含量进行回归分析(图10)，结果显示，ZmGLDH基因表达量与玉米叶内AsA含量呈正相关关系，R2=0.822 8，说明盐胁迫下玉米叶片细胞内ZmGLDH基因的表达水平是影响叶内AsA含量的主要因素。

图10 盐胁迫下玉米ZmGLDH基因表达量与叶内AsA含量的回归分析

3 结论与讨论

L-半乳糖途径被公认为是高等植物中合成AsA的主要途径，该途径的最后一步由GLDH催化L-半乳糖酸-1，4-内酯转变成L-抗坏血酸，是AsA合成的关键步骤。GLDH定位于线粒体内膜上，需要氧化态的细胞色素C(Cytochrome C，CytC)作为电子受体，CytC被还原，再把电子传递给复合体Ⅳ[11]。因此，AsA的从头合成与呼吸链电子传递状况有关。很多研究表明，GLDH基因的表达水平与植物体内的AsA含量密切相关[16-19]。本研究以玉米为材料，克隆了玉米GLDH基因，研究了ZmGLDH基因在盐胁迫条件下的表达特性，测定了盐胁迫下玉米叶片中AsA含量的变化，结果表明，ZmGLDH基因在盐胁迫条件下表达量的变化趋势与玉米叶片中AsA含量的变化趋势基本一致。GLDH在植物AsA的生物合成途径中所起的关键作用越来越受到研究者的重视，有关GLDH的生物化学特性、酶学特征、分子生物学特性、功能等方面的研究，也受到了业界的高度关注，并取得了一定的进展[20-21]。相信随着研究的不断深入，人们可以通过调控GLDH基因表达，实现对植物AsA生物合成的调控，为提高植物AsA含量并提高植物的抗逆能力提供一条有效途径。

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