张 超，李昌平，聂 娇

（1.宜宾市第一人民医院消化内科，四川宜宾 644000；西南医科大学附属医院，2.消化内科，3.老年病科，四川泸州 646000）

非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的代谢应激性肝损伤，以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变为主要病理特征，其疾病谱包括单纯脂肪肝、脂肪性肝炎和脂肪性肝硬化［1］。在一般人群中，目前多数研究得到的NAFLD的发病率为6%～12%，但全部研究得出的发病率为3%～24%［2］。NAFLD的发病机制尚不十分明确，目前广泛接受的是“二次打击”学说［3］。肥胖、血脂紊乱、糖尿病和代谢综合征是NAFLD的肯定危险因素。伴随肥胖和代谢综合征发病率不断升高，NAFLD已经成为我国和西方国家常见的肝病之一，是许多代谢性疾病的促进因素［4］。目前认为，治疗NAFLD的首要目标是改善肝脂质沉积、肝脂肪变性及胰岛素抵抗，次要目标是防止“二次打击”和肝功能代偿，减少或防止肝癌、肝硬化及并发症的发生［5］。脂质代谢紊乱和脂质在肝细胞中蓄积是NAFLD发病的“初次打击”，是NAFLD发生发展的基础。肝是脂质代谢的重要器官，其中包括脂肪酸的合成、甘油三脂（trigluceride，TG）和胆固醇的合成及分解代谢。当摄入高脂饮食或因脂蛋白酶的活性降低引起外周脂肪组织分解释放出的游离脂肪酸（free fatty acid，FFA）增多，通过门脉进入肝的FFA过多，不能完全被肝氧化利用，导致肝内脂肪蓄积，TG合成增多，形成脂肪肝。同时，大量脂质在肝蓄积，诱导了肝脂肪酸氧化反应的增加。增加的氧化反应产生了大量的氧自由基，当机体内抗氧化物耗尽时，便会发生氧化应激反应，损伤肝细胞，产生脂肪性肝硬化。同时，氧化应激损伤肝细胞后肝脂质代谢能力降低，加重肝脂质蓄积和胰岛素抵抗［6］。肝细胞炎症激活肝星状细胞分泌纤维素，促进肝纤维化发生，最终形成肝硬化。因此，脂质代谢紊乱在NAFLD发生发展过程中起至关重要的作用。目前治疗NAFLD尚无特效药物，且临床使用的大部分药物在治疗的同时还存在一定副作用，疗效也无法肯定。NAFLD患病率在我国逐年升高，亟需找到一种安全、有效、价廉的治疗药物。槲皮素（quercetin）是从植物中提取出的一种黄酮类化合物，广泛存在于许多植物的花、叶和果实中，具有多种生物学活性及很高的药用价值。研究证实，槲皮素具有抗氧化［7］和抗炎［8］等作用。槲皮素对 NAFLD 的治疗有明确的疗效，主要通过抑制促炎因子相关基因的表达、抗氧化应激、减少脂质合成、增加脂肪酸氧化和改善胰岛素抵抗等，但其治疗NAFLD的机制复杂，目前尚未阐明。脂质在肝中的蓄积是NAFLD的重要特点，也是其发生发展的关键环节。通过大量的实验证实，槲皮素能显著减少肝脂质蓄积，减轻肝脂肪变性。硬脂酰辅酶A去饱和酶1（stearyl coenzyme A saturated enzyme 1，SCD1）是脂肪酸合成的关键酶，催化单不饱和脂肪酸的合成。肝X受体α（liver X receptor α，LXR-α）是细胞内重要的核受体。研究证实，LXR-α参与了胆固醇和TG的合成、吸收、转运和排泄等过程，在胆固醇和TG代谢中起关键作用。SCD1和LXR-α是调控肝脂质代谢的关键因素。因此，SCD1和LXR-α可能是槲皮素治疗NAFLD的靶点。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂和仪器

雄性SD大鼠，56只，4周龄，清洁级，体质量200～250 g，由西南医科大学动物实验中心提供，分笼饲养，温度22～25℃，湿度50%～60%，本实验通过西南医科大学伦理委员会伦理审查。戊巴比妥钠30 mg·kg-1，ip麻醉处死。

2%胆固醇和0.5%胆酸钠（上海蓝季生物科技有限公司）；饲料（成都达硕动物科技有限公司）；槲皮素（美国Sigma公司，批号为A007-5）；小鼠抗兔SCD1及LXR-α单克隆抗体（美国Abcam公司，批号分别为20140512和20140365）；山羊抗兔IgG多抗（美国CST公司，批号7074）；RNA提取试剂盒（美国Invitrogen Life Technologies）；First Strand cDNA Syntheswas Kit（日本TOYOBO公司）；SYBR®Premix Ex Taq™试剂盒（日本TaKaRa公司）；PCR引物（Invitrogen Biotechnology Co，LTD中国公司合成）；羧甲纤维素钠（青岛四维化工有限公司，批号为130603771）。

Hitachi7060全自动生化分析仪（日本）；恒温水浴箱（科析实验仪器厂）；全自动凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；光学显微镜（日本Olympus公司）；台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；PCR仪（杭州博日科技有限公司）；超净工作台（苏州华新净化空调有限公司）；电泳仪（北京市六一仪器厂）。

1.2 分组及给药

SD大鼠适应性喂养1周后随机分为正常对照组（16只）和高脂模型组（40只），分别饲以普通饲料和高脂饲料，8周后，每组各取8只进行体质量测定、病理和血生化检查，以确认造模成功。剩余32只高脂模型组大鼠随机分为4组：模型组及槲皮素75，150和300 mg·kg-1治疗组，继续饲以高脂饲料；正常对照组剩余的8只大鼠继续饲以普通饲料。各组大鼠每天按相应剂量ig给药或等体积生理盐水。于第12周末测体质量后处死所有大鼠，留取血液，测血清谷草转氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase，GOT）、谷丙转移酶（glutamate pyruvic transaminase，GPT）、总胆固醇（total cholesterol，TC）及TG水平；留取大鼠肝组织，进行HE染色、免疫组化检测、PCR检测和Western蛋白印迹检测。

1.3 HE染色进行肝组织病理观察

取一叶肝组织于4%多聚甲醛中固定48 h，然后进行乙醇逐级脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，3 μm连续切片，再进行HE染色，在医学光学显微镜下进行肝组织病理观察。NAFLD大鼠脂肪变性程度依据肝细胞脂肪变性占据所获取肝组织标本量的范围判定，分为5度（F0～F4）：F0，＜5%肝细胞脂肪变性；F1，5%～30%肝细胞脂肪变；F2，30%～50%肝细胞脂肪变性；F3，50%～75%肝细胞脂肪变性；F4，75%以上肝细胞脂肪变性［3］；NAFLD炎症程度可分为4级（G0～G3）：G0，无炎症；G1，腺泡3带呈现少数气球样肝细胞，腺泡内散在个别点灶状坏死；G2，腺泡3带明显气球样肝细胞，腺泡内点灶状坏死增多，门管区轻至中度炎症；G3，腺泡3带广泛的气球样肝细胞，腺泡内点灶状坏死明显，门管区轻至中度炎症和（或）门管区周围炎症。

1.4 免疫组化法检测SCD1和LXR-α蛋白的表达

按照SP免疫组化染色试剂盒及DAB显色试剂盒说明书进行，在普通光学显微镜下观察，每张切片随机选取5个高倍光镜视野并拍照，细胞核或细胞浆被染成棕黄色为阳性。对拍摄照片中的阳性部位使用Image pro-plus 6.0图像分析软件选择图片上免疫组化反应物的黄色区域，然后测量这些区域的积分吸光度值（integrated absorbance，IA）表示目标蛋白的表达水平。

1.5 RT-qPCR测定SCD1和LXR-α mRNA的表达

按照试剂盒说明书，采用Trizol法提取总RNA，按RT-PCR试剂盒操作合成cDNA，并置于-20℃保存备用。使用荧光定量PCR扩增，并实时检测DNA量，反应条件：预变性95℃，1 min；循环（40次）95℃，15 s → 58℃，20 s → 72℃，20 s；末段延伸72℃，5 min；溶解曲线 72℃ → 95℃，每20 s升温1℃。GAPDH上游引物 5′-CGCTAACATCAAAT⁃GGGGTG-3′，下游引物 5′-TTGCTGACAATCTT⁃GAGGGAG-3′，扩增片段长度201 bp；SCD1上游引物 5′-GAAGACATCCGTCCTGAAATGAG-3′，下游引物5-CCGAGCCTTGTAAGTCCTGTG-3′，扩增片段长度264 bp；LXR-α上游引物5-AAC⁃GAGCTATGCAGTGTATGTGG-3′，下 游 引 物 5′-TGCTCCTCTTCT-TGACGCTTC-3′，扩增片段长度275 bp，结果采用2ΔΔCT法分析。

1.6 Western蛋白印迹法检测LXR-α蛋白表达

提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度，煮沸5 min变性后，进行SDS-PAGE凝胶电泳，半干转印，5%脱脂牛奶封闭2 h，一抗（1∶1000）4℃过夜，TBST洗膜；二抗（1∶2000）温室孵育，洗膜3次；化学发光检测。Image Tool 3.0软件分析IA值，β肌动蛋白为内参蛋白，待测蛋白相对表达水平用IA目标蛋白/IAβ肌动蛋白比值表示。

1.7 统计学分析

所有数据采用SPSS17.0软件进行统计学分析，计量资料正态分布用x±s表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。等级资料组间比较采用秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 非酒精性脂肪肝模型大鼠的体质量、肝组织及血清生化指标

与正常对照组大鼠体质量（336±48）g比较，高脂饲养8周后，模型组大鼠体质量〔（400±41）g〕增加（P＜0.05）；血清GOT，GPT，TC及TG水平均提高〔52±56vs（70±7）U·L-1，117±34vs（129±18）U·L-1，1.20±0.29 vs（1.60±0.17）mmol·L-1，0.60±0.57 vs（0.75±0.13）mmol·L-1，P＜0.05〕。HE染色显示，肝细胞分布紊乱，肝窦变形，肝细胞水肿，含有大量脂肪空泡，成气球样改变，胞质疏松浅染。肝索和小叶结构明显紊乱，有不同程度的炎症细胞浸润和肝细胞局灶性坏死（图1），提示NAFLD模型制备成功。

Fig.1Pathological observation of nonalcoholic fatty liver disease（NAFLD）model rats by HE staining.Fiftysix male rats were divided into normal control group(n=16)and model group(n=40)randomly.The rats of normal control group were fed with a common diet and the rats of model group were fed with a high fat diet for eight weeks,then,8 rats from each group were sacrificed to confirm the NAFLD model was success⁃fully developed.The arrow shows fatty degeneration and inflam⁃matary cell infiltration.

2.2 槲皮素对非酒精性脂肪肝模型大鼠体质量的影响

12周末，与正常对照组相比，NAFLD模型组大鼠体质量明显增高（P＜0.05）；与模型组比，槲皮素各治疗组大鼠体质量明显减轻（P＜0.05）（图2），提示高脂导致的体质量增加得到控制。

Fig.2 Effect of quercetin on body mass of rats with NAFLD.At the end of 8 weeks，rats were ig administrated with quercetin 75，150 and 300 mg·kg-1daily for four weeks，respectively.x±s，n=7-8（a rat in quercetin 150 mg·kg-1group died of bucking when gavaging）.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with model group.

2.3 槲皮素对非酒精性脂肪肝模型大鼠血清生化指标的影响

12周末，与正常对照组比较，NAFLD模型组大鼠血清GOT，GPT，TC及TG水平均升高（P＜0.01）。与模型组比，槲皮素300 mg·kg-1治疗组大鼠血清GOT，GPT和TC水平均降低（P＜0.05），槲皮素各治疗组大鼠血清TG均降低（P＜0.05，P＜0.01），提示槲皮素能逆转NAFLD大鼠血脂的升高（表1）。

2.4 槲皮素对非酒精性脂肪肝模型大鼠肝组织病理改变的影响

HE染色普通光学显微镜下观察（图3）发现，正常对照组大鼠肝小叶结构清晰完整，肝细胞索状呈放射状排列在中央静脉周围，胞浆呈均匀一致的红染状态；NAFLD模型组大鼠肝细胞分布紊乱，肝窦变形，肝细胞水肿，含有大量脂肪空泡，成气球样改变，胞质疏松浅染，肝索和小叶结构明显紊乱，有不同程度的炎症细胞浸润和肝细胞局灶性坏死。槲皮素各治疗组大鼠肝小叶结构尚存，肝细胞有不同程度的脂肪变性，但较模型组减轻，有少许炎症细胞浸润，未见肝细胞局灶性坏死。与正常对照组相比，模型组脂肪变性评分和炎症评分显著升高（P＜0.01），槲皮素150和300 mg·kg-1治疗后，各评分均降低（P＜0.05，P＜0.01）（表3）。

2.5 槲皮素对非酒精性脂肪肝模型大鼠肝组织SCD1和LXR-α 蛋白表达的影响

免疫组化结果显示（图4），与正常对照组比较，模型组SCD1蛋白IA值降低（P＜0.01），LXR-α蛋白IA值升高（P＜0.01），提示高脂饮食使NAFLD模型大鼠SCD1蛋白表达降低，LXR-α蛋白表达增高。与模型组比较，槲皮素150和 300 mg·kg-1组SCD1蛋白IA值升高（P＜0.05，P＜0.01），LXR-α蛋白IA值降低（P＜0.05，P＜0.01），提示槲皮素可上调NAFLD大鼠低表达的SCD1蛋白，下调高表达的LXR-α 蛋白。

2.6 槲皮素对非酒精性脂肪肝模型大鼠肝组织SCD1和LXR-α mRNA水平的影响

与正常对照组比较，NAFLD模型组SCD1 mRNA表达水平显著降低（P＜0.01），LXR-α mRNA表达水平显著升高（P＜0.01）。与NAFLD模型组比较，槲皮素150和300 mg·kg-1组SCD1 mRNA表达水平升高（P＜0.01），槲皮素75，150和300 mg·kg-1组 LXR-α mRNA 表达水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。提示槲皮素能上调NAFLD大鼠低表达的SCD1 mRNA，下调高表达的LXR-α mRNA（图5）。

Tab.1 Effect of quercetin on levels of glutamate pyruvic transaminase（GOT），glutamic oxaloacetic transami⁃nase（GPT），total cholesterol（TC）and trigluceride（TG）in serum of rats with NAFLD

Fig.3 Effect of quercetin on hepatic pathology of rats with NAFLD by HE staining.See Fig.2 for the rat treatment.Arrows show fatty degeneration and inflammatary cell infiltration.

Tab.3 Effect of quercetin on liver steatosis and inflammation in rats with NAFLD

Fig.4 Effect of quercetin on protein expression of stearyl coenzyme A saturated enzyme 1（SCD1）and liver X receptor α （LXR-α ）in rats with NAFLD by immunohistochemical method.See Fig.2 for the rat treat⁃ment.B was the semi-quantitative results of A.IA：integrated absorbance.x±s，n=7-8（a rat in quercetin 150 mg·kg-1group died of bucking when gavaging）. ＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05,##P＜0.01，compared with model group.

Fig.5 Effect of quercetin on mRNA level of SCD1 and LXR-α in rats with NAFLD.See Fig.2 for the rat treatment.x±s，n=7-8（a rat in quercetin 150 mg·kg-1group died of bucking when gavaging）. ＊＊P＜0.01，compared with normalcontrol group；#P＜0.05,##P＜0.01，compared with model group.

2.7 槲皮素对非酒精性脂肪肝模型大鼠肝组织LXR-α蛋白表达水平的影响

Western蛋白印迹结果（图6）显示，与正常对照组比较，NAFLD模型组LXR-α蛋白表达水平显著增加（P＜0.01）。与NAFLD模型组比较，槲皮素75，150和300 mg·kg-1组LXR-α蛋白表达水平降低（P＜0.01），提示槲皮素能下调高脂饮食大鼠高表达的LXR-α蛋白。

Fig.6 Effect of quercetin on protein expression of LXR-α in rats with NAFLD by Western blotting.See Fig.2 for the rat treatment.B was the semi-quantitative result of A.x±s，n=7-8（a rat in quercetin 150 mg·kg-1group died of buck⁃ing when gavaging）. ＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01，compared with model group.

3 讨论

本研究采用高脂饮食方法诱导大鼠NAFLD，模型组大鼠体质量增加，血清GOT，GPT，TC及TG水平明显升高；模型组大鼠肝组织HE染色光镜观察显示肝细胞分布紊乱，肝细胞水肿，含有大量脂肪空泡，成气球样改变，肝索和小叶结构明显紊乱，有不同程度的炎症细胞浸润和肝细胞局灶性坏死。上述结果表明，高脂饮食方法成功诱导大鼠NAFLD，此结果与文献报道结果［2］一致。

本研究结果显示，槲皮素处理可降低模型大鼠升高的GOT，GPT，TC和TG水平，上调低表达的SCD1蛋白，下调高表达的LXR-α蛋白，表明槲皮素对高脂饮食诱导的NAFLD大鼠有确切的治疗效果，此结果与文献［9］报道的结果一致。

本研究显示，12周末，NAFLD模型组大鼠肝SCD1 mRNA和蛋白表达显著减少。SCD1是催化单不饱和脂肪酸合成的关键酶，是脂肪酸从头合成中的关键调控点［10］。NAFLD肝中蓄积的脂肪酸主要来源于从食物中摄入和脂肪酸的从头合成。肝脂肪酸从头合成的量受到体内外多种因素的控制，包括食物中脂肪酸的含量、体内激素调控、基因调控等。当从食物摄入过量的脂肪酸时，FFA经门静脉系统进入肝，在肝中重新合成TG，沉积在肝组织中导致肝脂肪变性。瘦素由脂肪细胞分泌，其功能主要为抑制食欲，刺激机体能量消耗［11］。Cohen等［12］研究显示，scd1基因是瘦素信号的靶基因。当大鼠摄入大量高脂饮食时，一方面吸收进入体内在肝中重新合成TG；另一方面高脂饮食激活瘦素基因，使其表达增加，通过神经肽通路抑制scd1基因的表达，同时抑制大鼠食欲。因此，SCD1 mRNA表达水平降低可能与高脂饮食引起的体内高瘦素血症有关，本研究结果与文献报道一致［13］。以上表明，SCD1参与了NAFLD的发病。

本研究结果显示，模型组大鼠肝LXR-α mRNA和蛋白表达水平显著增高，与文献［14］报道结果一致。Kalaany等［15］在LXR-α缺失的小鼠上发现，当小鼠摄入高脂饮食时发生进一步的脂质蓄积，证实了LXR-α控制高脂饮食中脂肪的储存与氧化代谢平衡。LXR-α对脂质代谢的调控作用主要通过固醇调节原件结合蛋白1C（sterol regulatory elementbinding protein 1C，SREBP-1C）介导［16］，SREBP-1C启动子中包含了LXR-α结合位点，因而LXR-α控制着SREBP-1C的转录水平。SREBP-1C是重要的核受体，参与FFA及糖代谢基因表达，如脂肪酸合成酶、乙酰辅酶A羧化酶和硬脂酰基辅酶A脱氢酶等。由此可知，LXR-α控制着肝脂质代谢，当机体摄入高脂饮食时，刺激LXR-α基因表达增加。

综上所述，SCD1和LXR-α参与了大鼠NAFLD发病，其机制与增加SCD1表达和降低LXR-α表达有关，为槲皮素作为潜在治疗NAFLD药物提供一定的理论依据。但槲皮素作用机制是否还通过其他途径及临床疗效仍需进一步探讨。

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