陈兰煊 任 思 易翠平

(长沙理工大学化学与生物工程学院健康谷物制品研究所，长沙 410114)

淀粉结合蛋白(starch granule-associated proteins，SGAPs)是和植物淀粉粒表面或内部紧密结合的蛋白质，蛋白质量分数为0.2%～0.5%[1]。研究发现，SGAPs参与谷物淀粉的合成与代谢，其含量及表达决定了淀粉颗粒中直链淀粉与支链淀粉的分布[2]，由此影响谷物的加工品质。但近年来，关于SGAPs的研究主要集中在蜡质基因在不同植物组织中的表达、电泳等方法分离不同品种或籽粒的同工酶等方面[3-6]，而对于SGAPs与淀粉的相互作用和对淀粉的基本性质的影响鲜有报道。

1 SGAPs的概述

1986年，淀粉结合蛋白(starch granule-associated proteins，SGAPs)这一概念第一次被正式提出[1]，指天然位于淀粉粒表面或内部的一类蛋白，它们不同于储藏蛋白(谷蛋白、清蛋白、醇溶蛋白及球蛋白)和细胞内蛋白[7]。目前为止，不同来源的植物淀粉中发现了多种SGAPs，它们均含有大量的疏水性氨基酸，部分SGAPs是淀粉生物合成或降解后 “留下”的酶，因此形成了颗粒内外将其紧密包裹的结构。由于SGAPs与淀粉颗粒结合紧密，含量较少，分离也较困难，因此常采用十二烷基硫酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DDT)等强极性溶剂对其进行提取，并以SDS-PAGE凝胶电泳分析不同种类SGAPs的分布情况[8]。根据相对分子质量大小，这些SGAPs被分成两大类[9-10]：结合在淀粉颗粒表面的低相对分子质量SGAPs(Ms 5、8、15、19、30 ku)；存在于淀粉颗粒的内部的高相对分子质量SGAPs(Ms 60、77、86、95、149 ku)。

一般大米淀粉中可分离出3种较为典型的SGAPs：60 ku左右的淀粉合成酶(granule-bound starch synthase，GBSS)又称蜡质蛋白(waxy protein)，这种蛋白分为2种亚型GBSSⅠ和GBSSⅡ；30 ku的蛋白以及15 ku的一组复合肽段被统称为friabilin蛋白，其中puroindoline A (PINA)和puroindoline B (PINB)两种多肽表现较为突出[2, 11]。

2 SGAPs的分离纯化

2.1 低相对分子质量SGAPs的分离

SGAPs与淀粉颗粒间以多种复杂化学键紧密连接，研究表明，采用NaCl溶液、2-丙醇、十二烷基硫酸钠(SDS)和二硫苏糖醇(DTT)等强极性溶液对淀粉颗粒进行搅拌浸泡可分离出一部分SGAP。如用盐溶液0.1 mol/L的NaCl;0.05 mol/L的NaCl;1%～2%SDS(含有1%β-巯基乙醇)；10 mmol/L DDT,SDS-PAGE缓冲溶液或甲苯在室温条件下均可将低相对分子质量的SGAPs(5～30kDa)从淀粉粒中提取出[12]。然而这些溶液不能提取出全部淀粉粒表面SGAP，Lowy等[13]报道NaCl溶液提取物只有总SGAP的10%。Turnbull等[14]证明1%～2% SDS不能得到最多的SGAPs，采用10% SDS溶液进行提取可获得更多的SGAPs。

2.2 高相对分子质量SGAPs的分离

对于相对分子质量较高的内部SGAPs，无论采用高盐浓度还是低盐浓度缓冲液都无法将其分离出来。这部分蛋白被包埋在淀粉颗粒的内部，在普通条件下反应试剂无法与颗粒内部SGAPs作用，但可在≥50℃时用含有还原剂的1%～2% SDS溶液萃取膨胀糊化淀粉粒提取淀粉粒内部高相对分子质量SGAPs(59～149 kDa)。据Bancel等[12]报道，淀粉颗粒部分膨胀糊化后，分子的有序结构被打破，结合在淀粉颗粒内部的SGAPs暴露在溶液中与SDS或DTT等缓冲液进行反应解离出内部SGAPs。可以发现在对于SGAPs的分离过程中不同的提取溶剂浓度以及不同的提取条件会对提取的SGAPs的含量和质量产生较大影响，张军杰等[15]证明，采用SDS溶液对玉米籽粒中的SGAPs进行提取时，10% SDS缓冲液为最佳提取浓度，在此浓度下SGAPs达到358.723 μg/g，对于在煮沸提取时，当煮沸时间达到5 min时所提取的SGAPs蛋白量最高。此外，郭华等[16]研究表明，在SGAPs提取过程中Mg2+对GBSS的解离有显著影响，初步证实GBSS与淀粉粒主要是通过非共价键结合。这一研究结果进一步证明了有部分SGAPs是通过化学键与淀粉粒结合，因此SGAPs与淀粉的结合力可能受到不同离子的影响，随离子类型与强度的变化而变化。闫荣[17]采用不同缓冲液对淀粉分子处理发现，硫脲、SDS、L-半脫氨酸试剂以及改变溶液体系pH对淀粉中SGAPs的提取的率有显著影响，说明淀粉颗粒与SGAPs之间主要依靠疏水作用、氢键和静电引力结合，其中表面SGAPs主要通过疏水作用力、静电引力与淀粉结合，而内部SGAPs则主要通过氢键。由此可见，SGAPs与淀粉分子之间的复合不是由单一作用完成,而是以多种分子间作用力包括共价键、氢键、离子键、二硫键等作用力及分子缠绕等作用的综合结果。

2.3 大米中SGAPs的分离

有学者将大米蛋白分为可提取蛋白(含醇溶蛋白、谷蛋白等贮藏蛋白及具有酶活性的清、球蛋白)和不可提取蛋白(淀粉结合蛋白)[17]。易翠平等[18]曾报道，以碱法制备大米淀粉可分离出高纯度的大米淀粉及大米蛋白，在分离大米淀粉的过程中得到三层形态不一的淀粉，分别是最上层的淀粉糊精，中层白淀粉(即高纯度精制淀粉)，下层黄淀粉。但值得关注的是碱法所提的高纯度大米淀粉中依然含有0.39%的蛋白质，结合以往SGAPs质量分数在0.2%～0.5%之间的报道，有理由推测此部分蛋白主要是紧密嵌入在淀粉粒表面及内部的SGAPs。在Adebiyi等[19]的米糠蛋白分级实验当中也发现，经过逐级提取后的米糠淀粉颗粒中仍有0.2%的蛋白存在。因此，考虑采用去蛋白淀粉或精制白淀粉为原料对SGAPs进行分离可能是更为简便的方法。Han等[20]也发现碱提大米淀粉中保留了一部分SGAPs，颗粒结合型淀粉合成酶(GBSS)在大米淀粉在碱性提取过程中有部分丧失，通过对比经过不同分离阶段淀粉的糊化特性变化发现，SGAPs对淀粉糊化特性有显著影响。

3 不同分子质量的SGAPs对淀粉基本品质的影响

淀粉分子在稻米中以颗粒的形式存在。尽管SGAPs的形成过程非常复杂，含量较少，分离也较困难，但它的存在对于淀粉的合成、品质、结构、理化性质等具有重要的作用[21]。结合在淀粉颗粒内部的SGAPs常常表现为各种与淀粉相关的合成酶，与直链淀粉紧密结合在一起影响籼米的基本性质：降低糊的黏度，通过增加淀粉凝胶的硬度而降低由剪切引起的淀粉破损等。在目前这些已知的SGAPs里，Han等[20]证明SGAPs对淀粉糊化特性显著影响；Fujita等[22]证明GBSS I与淀粉的合成紧密相关，可以延长直链淀粉和支链淀粉的外链长度；friabilin蛋白对籽粒质地及硬度有明显影响。

3.1 非酶类SGAPs对淀粉基本品质的影响

3.1.1 Friabilin/puroindoline蛋白

相对分子质量为15 ku的低相对分子质量SGAPs被认为是在谷物颗粒生长过程中影响胚乳硬度的首要因素。1988年，Spencer[23]从软质小麦中提取出并用SDS-PAGE电泳分析证明15 ku的蛋白与小麦籽粒的硬度极显著相关，首次将其命名为friabilin蛋白。随着分离和检测方法的发展，根据多个N-末端氨基酸残基的检测发现 15 ku的蛋白是由几组质量相近的多肽构成，其主要组成成分为puroindoline-a 和-b，遗传分析表明 PINA 和PINB 基因位于染色体Ha(hardness)位点的5D染色体上[7]，这是一类富含半胱氨酸的亲脂膜蛋白。Friabilin与谷物胚乳品质密切相关，影响其制粉和用途。Morrison等[24]采用英国小麦研究表明非极性脂的含量与籽粒硬度有高度相关，非极性脂类含量越高则胚乳硬度越低，而puroindoline基因能影响淀粉颗粒中非极性脂类的合成[25]。PINA和PINB的特性还对胚乳内蛋白质与淀粉颗粒的结合一定有影响，直径较小的B-级淀粉颗粒较大的A-级淀粉的friabilin/puroindoline蛋白含量更高，且呈不连续形态附着于颗粒表面[26-27]。常成等[28]在研究puroindolines蛋白在小麦籽粒的发育时期与硬度的关系发现，在软质和硬质小麦籽粒不同发育时期，其表达是有差异的——软质小麦籽粒淀粉粒表面结合 puroindolines蛋白量显著高于硬质小麦。郭世华等[29]研究发现friabilin蛋白表达量与籽粒硬度呈显著负相关，friabilin谱带强，籽粒硬度数值低，与软麦和硬麦的SKCS测定值之间的关系数为-0.68和-0.66，达到了1%的显著水平。因此puroindoline蛋白的含量、结构、基因型等均与谷物胚乳的硬度有着十分密切联系。大米淀粉中也被证实30 ku的friabilin蛋白的存在，但friabilin蛋白对大米籽粒的硬度是否有影响尚鲜见研究报道。

3.1.2 30 ku肽段

不同于friabilin/puroindoline蛋白，对于30 ku的肽段研究鲜有报道。Lowy等[13]和Debet等[30]采用0.1 mol/L NaCl将位于淀粉颗粒表面的这部分蛋白分离出来，且DTT等还原剂与这部分蛋白提取率非显著性相关，证明这部分蛋白并非以二硫键与淀粉颗粒结合。同时Lowy等[13]发现该蛋白在发芽的谷物中不存在，表明这部分蛋白是发芽稻米用于代谢的蛋白。韩永斌等[31]通过对比发芽前后的糙米的糊化特性发现，糙米发芽后，30 ku肽段消失，与含有30 ku肽段的未发芽糙米比较，淀粉糊黏度降低。

3.2 生物酶类SGAPs对淀粉基本品质的影响

60 ku的GBSS是合成直链淀粉的关键酶，也是与淀粉颗粒结合的大米发育过程中唯一有酶活力的蛋白。GBSS有两种同工酶，即GBSS I和GBSSⅡ，前者主要存在于籽粒储藏器官中控制合成线性葡聚糖，后者主要存在于非贮藏组织，如叶、绿茎等合成直链淀粉[1]。编码GBSS的基因位于染色体的‘糯’位点上，因此被称为Waxy基因。当Waxy基因的缺失或突变时，胚乳中直链淀粉合成减少，支链淀粉含量上升。糯性水稻也是由于Waxy基因的突变导致无法正常合成直链淀粉，直链淀粉质量分数一般在2%左右。Pandey等[32]报道GBSSI在淀粉合成过程中作用于支链淀粉外侧的葡萄糖链使之延长，使淀粉中的某些非结晶性区域转变为结晶区域。虽然目前鲜有关于GBSS含量或结构等与淀粉糊化特性的相关性的系统研究，但却可以发现GBSS在淀粉合成过程中通过决定淀粉颗粒的基本特性而影响大米淀粉的糊化特性，如GBSS决定了淀粉颗粒中直支比及聚合度。研究发现直链淀粉含量与淀粉糊化特性呈显著正相关；GBSS对淀粉结晶区域和支链淀粉的晶型结构均有很大影响[33]，而大米淀粉的糊化温度随着结晶区和非结晶区比例的减小而降低[34]。因此，GBSS作为生物酶紧密结合于淀粉颗粒内部，对淀粉的糊化特性有着很大影响。

据李艳等[35]报道，黄淀粉中的蛋白主要为蛋白体与纤维素的结合体，而白淀粉中所含的相对分子质量为60 ku的亚基可能对大米淀粉的糊化性质起着非常重要的作用。60 ku的GBSS是大米SGAPs的主要成分，它与淀粉的相互结合共同决定大米粉的基本糊化特性。

4 结语及展望

大米中SGAPs作为一种重要组分存在于淀粉颗粒之中，控制着淀粉颗粒的合成、结构及淀粉基本特性，并与其他组分共同作用，影响淀粉粒的基本性质乃至整个谷物体系的品质和应用。虽然早期的研究更多关注谷物中的储藏蛋白，但由于SGAPs与淀粉性质的密切相关性，近年来亦逐渐受到关注。现有研究虽表明SGAPs确实对淀粉品质有很大影响，但SGAPs的具体结合状态及其作用机制尚不明确，未来研究可考虑从SGAPs与淀粉颗粒结合构型及其生物代谢方式入手，明确SGAPs对淀粉颗粒的具体影响机制。

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