叶松华，王晓燕，董晓丽，冯夏珍，杨莹莹

（山西省医药与生命科学研究院，山西太原030006）

恶性肿瘤是常见且严重威胁人类生命主要疾病之一，寻找有效的抗肿瘤药物与方法，是世界医学界重要的研究课题。天然产物具有结构独特、生物活性广泛、不易耐药等优点，是发掘新颖抗肿瘤活性成分的重要源泉，也是有机合成和组合化学的补充。从天然植物中寻找活性成分，大规模快速筛选先导化合物，是发现新型天然抗肿瘤药物先进、快速、有效的筛选途径［1-2］。建立合理的抗肿瘤药物筛选的方法和高效、简便的筛选模型对抗肿瘤药物的研究具有重要的意义。

快速荧光素测定法是一种近几年发展起来的体外药物敏感性测定方法［3］，该技术因其具有简便、灵敏、稳定等特点得到了广泛应用，并已成为高通量筛选的关键技术之一。其原理是通过细胞酶的作用使无荧光性的材料分解或转换为荧光材料，通过测定荧光强度从而测定出活细胞的量。二乙酸荧光素（FDA）是一个非极性酯类化合物，能通过完整的细胞膜，在活细胞内被酯酶水解而产生极性的绿色荧光物质，该荧光物质不能通过完整的细胞膜，能在活细胞内保留，因此可用于活细胞标记并测定细胞活力［4-5］。

本研究建立了一种基于FDA标记活细胞的抗肿瘤活性物质快速筛选方法，并应用该方法对两种药用植物的抗肿瘤活性组分进行了初筛，为天然产物抗肿瘤活性物质研究提供了新方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

MEM培养基购自Gibco公司、胎牛血清（FBS）购自BI公司；荧光染料二乙酸荧光素（FDA）购自Sigma公司；青霉素-链霉素溶液、胰蛋白酶购自北京全式金生物技术有限公司；阿霉素对照品、牛胰岛素、非必需氨基酸、丙酮酸钠购自北京索莱宝科技有限公司。96孔细胞培养板，细胞培养瓶购自Coming公司。沙煲暗罗茎、海南染木树叶采自海南昌江县霸王岭自然保护区。乳腺癌细胞系MCF-7购自中国典型培养物保藏中心。

1.2 实验仪器

荧光倒置显微镜（德国ZEISS）；多功能微孔读板机 SyergyH1（美国伯腾）；CO2培养箱（美国Thermo）；HH数显三用恒温水箱（江苏金坛市金城国胜实验仪器厂）；超净台（苏州净化SW-CJ-2D）；低速离心机SC-3610（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；药物抑制浓度计算软件（GraphPad Prism 5.0，美国）。

1.3 荧光测定法的建立及考察

1.3.1 FDA浓度的选择 取对数生长期的MCF-7细胞，以0.25%胰蛋白酶消化后，以3 000个/孔接种于96孔板中间60孔，常规培养24 h后，弃去每孔中培养液，用PBS漂洗2次，加入100 μL/孔含系列浓度梯度 FDA（40 μg/mL，20 μg/mL，10μg/mL，5 μg/mL，2.5 μg/mL，1.25 μg/mL，0.625 μg/mL，0.313 μg/mL，0.156 μg/mL，0.078 μg/mL） 的 PBS溶液，每个浓度3个复孔，37℃培养孵育45 min后，立即置于多功能微孔读板机上，在激发波长为490 nm，发散波长为526 nm的条件下检测每孔的荧光强度，并绘制探针浓度和荧光强度的关系图。

1.3.2 方法的线性范围考察 取处于对数生长期的MCF-7细胞，以0.25%胰蛋白酶消化后，从1.5万个/孔按照倍半稀释的方式稀释为10个浓度，接种于96孔板的中间60孔，每个密度设3个复孔。常规培养24 h后，弃去每孔中培养液，用100 μL PBS 漂洗 2次，用含 FDA（2.5 μg/mL）的 PBS标记细胞，每孔 100 μL，37 ℃，孵育 45 min，立即置于多功能微孔读板机上检测每孔的荧光强度。以每孔的细胞个数为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。

1.3.3 方法的精密度考察 取处于对数生长期的MCF-7细胞，以0.25%胰蛋白酶消化后，以3 000个/孔接种于96孔板的中间60孔，常规培养24 h后，弃去每孔中培养液，按1.3.2项操作检测每孔的荧光强度，计算各孔荧光强度间的RSD，以考察该种方法的精密度。

1.3.4 方法的准确性验证 按常规方法接种肿瘤细胞，3 000个/孔。培养24 h后，加药组每孔加入100 μL含不同浓度阿霉素的培养液，阿霉素的终浓度分别为：40 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL、2.5 μg/mL、1.25 μg/mL、0.625 μg/mL，每个浓度设 3个复孔。阴性对照组加入相同体积培养液。培养48 h后，弃去每孔中培养液，按1.3.2项操作检测每孔的荧光强度，并按照下面的公式计算不同浓度阿霉素对肿瘤细胞的抑制率：抑制率（%）=（1-加药组荧光强度值／对照组荧光强度值）×100%。

1.4 药用植物化学组分的制备

将自然风干的沙煲暗罗茎进行粉碎，然后用95%乙醇浸提3次，每次7 d，将收集到的浸提液合并、减压蒸馏，最后得到乙醇总浸膏。然后将乙醇总浸膏分散于一定量的蒸馏水中，分别用石油醚和乙酸乙酯萃取3次，将所得的萃取液合并、减压浓缩，得到各部位浸膏，分别标记为1-1、1-2。

将海南染木树叶粉末，用85%的乙醇溶液浸泡提取 3 次，分别为 3 d，5 d，7 d，合并浓缩，得粘稠状浸膏；将浸膏分散在一定量的蒸馏水中，分别用石油醚、乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩得各极性部位浸膏，分别标记为2-1、2-2。

1.5 药用植物抗肿瘤活性部位的筛查

按常规方法接种肿瘤细胞，3 000个／孔。培养24 h后，加药组每孔加入100 μL含不同浓度提取物的培养液，使终浓度分别为：400 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、20 μg/mL、12.5 μg/mL、6.25 μg/mL，每个浓度设3个复孔。并分别以2.5μg/mL的盐酸阿霉素和含0.1%DMSO的培养液作为阳性对照和阴性对照。培养48 h后，弃去每孔中培养液，按1.3.2项操作检测每孔的荧光强度，计算不同组分对肿瘤细胞的抑制率。

2 结果

2.1 基于荧光信号的抗肿瘤活性物质筛选方法的建立及考察

2.1.1 FDA浓度对荧光强度的影响 本研究考察了10个不同荧光染料浓度下的细胞荧光信号强度。当FDA浓度达到≥20 μg/mL时出现平台期（图1中A）；而探针质量浓度在0～5 μg/mL时，细胞的荧光强度随着FDA浓度增加而增强（R2=0.987 8）（图1中B）。当探针质量浓度为2.5 μg/mL时，已能满足软件统计的要求，而浓度过大会产生较强的背景干扰，同时染料浓度过高可能会对细胞活力产生影响，故本文FDA染料浓度定为2.5 μg/mL。

2.1.2 方法学研究结果 实验结果表明（如图2），每孔接种细胞在68～1.5×104个/孔的范围内，荧光强度与每孔接种细胞数之间的线性关系良好，计算回归方程得，y=1.892 4x-534.16，R2=0.9967。连续扫描整个96孔板中60孔，发现其荧光强度变化值较小，其RSD为10.9%，表明该方法具有良好的板内精密度。

图1 FDA浓度对荧光强度的影响

图2 细胞密度与荧光强度的线性关系

2.1.3 方法的准确性验证 选择盐酸阿霉素作为阳性药对建立的方法进行验证，以考察本方法的可靠性，实验结果如图3所示。计算所得盐酸阿霉素抑制MCF-7细胞增殖的IC50值为3.04 μg/mL，与欧金来等［6］使用MTT法所检测到的结果2.7 μg/mL较为一致，说明本方法用于抗肿瘤活性物质筛选是准确可靠的。

图3 盐酸阿霉素对MCF-7细胞的抑制率与剂量的关系曲线

2.2 药用植物抗肿瘤活性部位的筛查

分别对沙煲暗罗茎和海南染木树叶的乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物（1-1，2-1）和石油醚萃取物（1-2，2-2），结果见表1。结果表明沙煲暗罗茎乙酸乙酯部位和石油醚部位、海南染木树叶石油醚部位对MCF-7细胞均有抑制作用且呈现剂量依赖性，经计算以上三个部位的IC50值分别为134.1 μg/mL、78.46 μg/mL 和 86.87 μg/mL。而海南染木树叶乙酸乙酯部位对MCF-7增殖的抑制作用不明显，只在最高浓度有较弱的抑制作用。

表1 各组分对MCF-7细胞的抑制率 （%）

根据表1中的数据，沙煲暗罗茎石油醚部位在浓度400 μg/mL时的抑制率为68.51%，反而低于200 μg/mL时的抑制率，这是由于该部位由高浓度的DMSO溶液向培养基溶液稀释的过程中，出现了较多的析出，使得培养基中的实际药物浓度不准确。因此，在计算IC50时，为保证结果的可靠性，只使用了6.25～200 μg/mL的数据。

3 讨论

本研究经过筛选合适的FDA浓度，建立了一种基于FDA荧光信号的抗肿瘤活性物质体外快速筛选方法，并用盐酸阿霉素做为阳性药对该方法进行了可靠性验证。经过线性范围和精密度的研究，对该方法进行了方法学考察，结果表明，本方法在68～1.5×104个/孔的范围内具有良好的线性关系。李宁等［7］对CCK-8法和MTT法检测人前列腺癌PC3细胞活性的最佳条件进行了比较，发现CCK-8法和MTT法检测PC细胞活细胞数时，线性范围分别是 8×102～5×104和 6.3×102～5×104。因此，本方法与传统的体外抗肿瘤活性物质筛选的方法相比，具有更高的灵敏性和更宽的线性范围。

应用荧光检测法对沙煲暗罗茎和海南染木树叶进行了抗肿瘤活性筛选，结果表明沙煲暗罗茎乙酸乙酯部位和石油醚部位、海南染木树叶石油醚部位对MCF-7细胞均有抑制作用且呈现剂量依赖性，为这两种药用植物抗肿瘤活性物质的进一步筛选和以及抗肿瘤单体分离奠定了基础。

本研究建立的荧光检测法具有快速、灵敏、细胞线性范围宽等特点，可用于天然产物抗肿瘤活性物质的体外快速高通量筛选，为天然产物药效物质基础研究提供了新的研究手段。

［1］顾琳娜，顾吴.天然抗肿瘤药物的筛选方法［J］.中草药，2009，40（4）：1-4.

［2］韩佳颖.半边莲抗肿瘤作用研究进展［J］.山西中医学院学报，2016（2）：71-72.

［3］陈军，战洪生.快速荧光素测定法在抗肿瘤药物筛选中的作用［J］.中国肿瘤临床，1996，23（7）：495-497.

［4］Proffitt R T，Tran J V，Reynolds C P.A fluorescence digital image microscopy system for quantifying relative cell numbers in tissue culture plates

［J］.Cytometry，1996（24）：204-213.

［5］Jin Y，Zhao X，Zhang Y，et al.A three-stage-integrative approach for the identification of potential hepatotoxic compounds from botanical products［J］.International Journal of Toxicology，2011，30（3）：287-299.

［6］欧金来，洪宝贤，叶小翠，等.阿霉素果胶纳米粒的制备及其体外抗肿瘤活性［J］.暨南大学学报（自然科学与医学版），2014，35（3）：330-336.

［7］李宁，万文婷，金林红.CCK-8法和MTT法检测人前列腺癌PC3细胞活性的最佳条件比较研究［J］.贵州大学学报（自然版），2009，26（3）：18-20.