孙羽中，陈富丽，窦志芳

（山西中医药大学，山西太原030024）

IBS作为多种症状存在的疾病，其发病机制十分复杂，目前尚未找到引起本病发生的真正原因，但多方研究显示，IBS的发病与精神情绪密切相关。所以本实验以IBS肝郁脾虚证为研究对象，以具有柔肝和脾作用的痛泻要方为干预方法，以和精神情绪密切相关的5-羟色胺（5-HT）为切入点，探讨痛泻要方对肠易激综合征肝郁脾虚证大鼠5-HT的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SD雄性大鼠120只，SPF级，体质量（180±20）g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK-（京）2012-0001；实验前，将动物置于实验室适应环境1 w，自由进食、饮水，室温（22±2）℃，正常昼夜节律。实验过程中实验动物的饲养管理和实验操作过程均遵守山西中医药大学实验室相关规定。

1.1.2 药材与试剂 番泻叶、痛泻要方颗粒剂（山西中医学院附属医院提供）；匹维溴铵（法国苏威制药厂）；5-HT试剂盒（上海哈灵生物科技有限公司）；4%多聚甲醛固定液（石家庄四药有限公司）；水合氯醛（天津市科密欧化学试剂有限公司）；0.9%氯化钠注射液（石家庄四药有限公司）。

1.1.3 实验仪器 外科手术器械（上海浦伦医疗器械有限公司）；鼠断头器（安徽省淮北正华微生物仪器设备有限公司）；LT1002B电子天平（常熟市天量仪器有限责任公司）；HC-2062高速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；KDC-1044低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；Fm100型雪花制冰机（美国格兰特化学公司）；KQ-500型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；SynergyTM H1全功能微孔板检测仪（美国伯腾（BioTek）仪器有限公司）；IKA T25高性能数显匀浆（分散）机（德国艾卡（IKA）公司）；EZQ-2旋涡振荡器（江苏省泰县医疗器械公司）；LEICA RM2235石蜡切片机（德国Leica公司）；EG1150C石蜡包埋机（德国Leica公司）；EXCELSIOR ES脱水机（美国赛默飞世尔科技Thermo）。

1.2 实验方法

1.2.1 分组与给药 SPF级SD雄性大鼠 120只，体质量（180±20）g，所有大鼠在恒湿、恒温、自由进食、进水及昼夜光线的房间内饲养1 w后，随机分为6组：正常组、病理组、痛泻要方低剂量组、痛泻要方中剂量组、痛泻要方高剂量组、西药（匹维溴铵）组，每组20只。造模过程中用番泻叶进行灌胃，治疗时，正常组及病理组大鼠给予生理盐水，西药组给予匹维溴铵，痛泻要方低、中、高剂量组分别给予痛泻要方相应浓度的溶液。

1.2.2 IBS肝郁脾虚证大鼠造模及治疗 除正常组外，其余各组大鼠按照先肝郁后脾虚刺激制备IBS肝郁脾虚证动物模型。先用橡皮胶束缚大鼠前肢，使前肢无法正常运动，每天检查一次，将挣脱橡皮胶的大鼠继续束缚，此过程连续进行2 w。然后在束缚的基础上进行番泻叶灌胃，将配好的番泻叶溶液按照每100 g大鼠灌胃1 mL的方法进行，每天灌胃1次，此过程持续7 d。

治疗过程中，西药（匹维溴铵）组、痛泻要方低、中、高剂量组分别将各组配制好的溶液按照每100 g大鼠灌胃1 mL的方法进行，正常组及病理组给予等体积的生理盐水，每天灌胃1次，持续7 d，然后进行相关指标的检测。

1.3 指标监测

1.3.1 血清5-HT含量的检测 造模结束后第3 h，一般状态观察结束后，大鼠均按1 mL/100 g剂量灌服3%D-木糖溶液，1 h后麻醉大鼠，腹主动脉取血，肝素抗凝试管中摇匀，4℃低温高速离心15min（3 000 r/min），取上层血浆，于-26 ℃冰箱冻存，检测前速融。使用大鼠5-HT酶联免疫分析（ELISA）试剂盒检测血清中5-HT的含量。

车身长/宽/高(mm) ..................................4543/2059/1196

1.3.2 结肠黏膜5-HT含量的检测 采血结束，剖腹分离结肠和直肠段，截取结肠约6 cm，再等分为3个2 cm的结肠段，以生理盐水冲洗，分别置入4%多聚甲醛固定液中，固定24 h后放入自动脱水机中自动脱水，石蜡包埋，连续切片（5μm），备用。

石蜡切片微波炉抗原修复的操作步骤：①石蜡切片常规脱蜡，蒸馏水冲洗3次；②用3%H2O2孵育8 min（主要根据实验室温度及其他条件决定），阻断内源性过氧化酶，用蒸馏水洗3次，每次5 min；③PBS冲洗3次，每次5 min；④把切片纳入装有0.01M枸橼酸盐缓冲液pH（6.0±0.1）的容器当中，放进微波炉内抗原修复10 min；⑤取出并在室温自然冷却后用PBS洗3次，每次5 min。

免疫组化染色步骤：①滴加适当的1∶100稀释兔抗鼠5-HT或NGF多克隆抗体，阴性对照用PBS代替一抗，4℃过夜；②用PBS冲洗3次，每次3 min；③滴加二抗工作液，在37℃孵育20 min；④用PBS冲洗3次，每次3 min；⑤DAB室温显色，光镜下控制反应时间；⑥自来水充分冲洗；⑦苏木素复染；⑧梯度酒精脱水，二甲苯透明中性树胶封片。每张完成染色的切片在OlympsDP70光学显微镜高倍镜400倍下观察。

远端结肠病理检查：取距肛门5～6 cm处远端结肠，用4%多聚甲醛固定液固定。HE染色后，显微镜下观察以下内容：固有层有无中性粒细胞浸润，间质有无水肿。

1.4 统计学方法

实验结果分析、统计图表绘制均采用Graphpad prism 5，统计结果以均数±标准差（±s）表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清中5-HT含量

与正常组比较，病理组血清中5-HT含量明显升高（P＜0.05）；与病理组比较，西药组及痛泻要方中、高剂量组5-HT含量显著降低（P＜0.05），其中高剂量组含量最为接近正常组。结果见表1。

表1 各组大鼠血清中5-HT含量检测结果 （ng/L，±s）

表1 各组大鼠血清中5-HT含量检测结果 （ng/L，±s）

注：与正常组比较，1）P＜0.05；与病理组比较，2）P＜0.05

组别 n 5-H T正常组 2 0 1 4 9.9 3±3 2.5 7病理组 2 0 2 3 3.9 8±2 6.7 1 1）低剂量组 2 0 1 4 1.7 7±3 3.1 2中剂量组 2 0 1 6 6.2 2±3 3.3 9 2）高剂量组 2 0 1 5 2.9 2±2 9.0 5 2）西药组 2 0 1 7 6.0 7±2 4.1 6 2）

2.2 结肠中5-HT含量

与病理组比较，治疗各组均明显下降，与正常组比较，病理组含量明显升高。痛泻要方高剂量组含量最接近正常组，痛泻要方中剂量组、西药组偏高。结果见图1。

图1 各组大鼠结肠5-HT免疫组化染色阳性细胞面积（Area）检测结果

3 讨论

3.1 IBS肝郁脾虚证是临床中最常见证型

中医没有与IBS相对应的病名，按照临床症状归于中医泄泻、便秘、腹痛等类别。IBS作为中医药治疗的优势病种，中医诊疗共识意见将IBS分为肝郁气滞、肝郁脾虚、脾胃湿热、脾虚湿阻、肠道燥热和脾肾阳虚6种证型。我们课题组对近20年相关文献统计发现，IBS肝郁脾虚证出现频率最高，占67.3%，而疏肝健脾法是临床中治疗IBS最主要的方法［2］。蔡俊晏［3］对我国近十年中医药治疗IBS的临床观察文献分析得出，肝郁脾虚证为临床最常见证型，痛泻要方是治疗IBS肝郁脾虚证最常用方剂。

中医理论认为，肝主疏泄，脾主运化，五行之中，肝木能够克脾土，肝木克脾太过则导致泄泻、便秘等肠道症状的发生。肝藏血，脑为髓海，脑髓依靠肝血的不断充养方成脑神之用。脑为元神之府，主神明而总统诸神，脑是情志的最高指挥官。过度的情志刺激可伤及脑神，脑神失控，则导致情志失常，情志失常则影响肝之疏泄，肝失疏泄，克土太过，则影响脾的运化而导致腹痛、腹泻、便秘等症状出现。肝主疏泄与藏血功能为联系脑神与脾运化功能的枢纽，脑-肝-脾是中医理论中有关消化方面最主要的脏器。

痛泻要方具有补脾土泄肝木，调气机止痛泻的作用。方中白术味苦甘而性温，有补脾燥湿之功，故可治土虚，是为君药；白芍味酸性寒，有柔肝缓急止痛之功，与白术相配，有土中泻木之效，是为臣药；陈皮味辛苦而性温，有理气燥湿、醒脾和胃之功，是为佐药；再配以防风少许，取其升散之性，与方中白术、芍药相伍，其辛可散肝郁，其香可舒脾气，并有胜湿以助止泻之功效，又可作为脾经之引经药，兼具佐使。四药相伍使肝和脾健，痛泻自止，是治疗IBS肝郁脾虚证最为对症的方剂。

现代医学认为，肠道的神经支配及调节由肠道神经系统（ENS）和中枢神经系统（CNS）协同完成，胃肠运动通过神经反射将胃肠道与CNS联系起来，在不同层次将胃肠道与中枢神经系统联系起来的神经-内分泌网络被称为脑肠轴［4］。脑肠轴作为人体一个巨大的神经内分泌免疫网络系统为双向通路，一方面刺激和将内在信息通过肠神经链与高级神经中枢相连结影响胃肠感觉、动力和分泌等；另一方面亲内脏作用又反过来作用于中枢的痛感、情绪和行为，即胃肠症状对心理状态有反作用［5］，这就是精神情绪可以影响胃肠功能的原因。

无论是中医的脑-肝-脾理论，还是现代医学理论的脑肠轴学说，都显示出心理状态与肠道疾病有着莫大的联系，而随着社会的进步，人们在金钱、物质等方面得到满足的同时精神压力也在增加，这或许是肝郁脾虚证型占如此大比重的原因。

3.2 5-HT分泌异常引起的临床表现与IBS肝郁脾虚证十分相似

脑肠肽是脑肠轴与大脑皮层-神经递质共同分泌的一些神经递质，具有神经递质和内分泌激素的双重身份，同时还承担着人体的免疫作用，而5-HT则是脑肠肽中非常重要的神经递质。机体内90%的5-HT由肠嗜铬细胞（EC细胞）分泌，少量由中枢内5-HT能神经元合成。精神心理因素与5-HT代谢有关，5-HT是重要的神经递质及神经肽，其代谢的异常与抑郁症的发病有着密切关系。人体内部的5-HT，其在中枢水平的改变可导致失眠、焦虑等精神行为异常，在胃肠道可导致腹痛、腹泻等表现。5-HT分泌释放引起的临床表现与我们探讨心理状态影响肠道疾病相吻合，5-HT通过在中枢的分泌影响机体的心理状态，而心理状态的改变进而导致胃肠运动的异常。王迎寒等［6］研究发现，5-HT与IBS肝郁脾虚证候密切相关。赵鲁卿等［7］研究也发现，疏肝健脾方对腹泻型肠易激综合征大鼠有较好治疗作用，其作用机制可能与降低5-HT的含量有关。所以我们有理由相信，5-HT是IBS肝郁脾虚证关系最为密切的脑肠肽，而痛泻要方则是通过柔肝和脾的功效来减少机体5-HT的分泌，进而缓解腹痛、腹泻等肠易激症状。

3.3 痛泻要方通过疏肝、柔肝减少5-HT的分泌从而改善IBS症状

从本次的实验数据来看，病理组大鼠血清和结肠的5-HT含量较正常组明显升高（P＜0.05），而通过低、中、高剂量的痛泻要方和匹维溴铵治疗之后，5-HT含量明显降低，且高剂量组的5-HT含量与正常组最为相近，说明痛泻要方和匹维溴铵可通过减少血清和结肠5-HT的含量来减轻IBS的症状。但我们前期研究表明［8］，匹维溴铵治疗IBS肝郁脾虚证大鼠仅仅缓解了胃肠道的运动异常，对于大鼠由于焦虑、抑郁等表现出的行为学异常没有明显的改善，说明匹维溴铵无法缓解大鼠精神情绪的异常，治疗效果不如痛泻要方全面。在中医理论中，肝木能够克脾土，精神情绪的异常对于胃肠道的刺激非常明显，而匹维溴铵无法缓解精神情绪的异常，只是改善了胃肠道的局部症状，无法从根本上治疗疾病，这或许是西药治疗后病情易反复的原因。

通过以上分析我们得出结论：痛泻要方通过疏肝、柔肝的作用，减少大鼠血清和结肠5-HT的含量，进而缓解IBS肝郁脾虚证大鼠的症状；匹维溴铵可以减少大鼠血清、结肠5-HT的分泌改善胃肠道动力的异常，但是无法缓解其抑郁、焦虑等心理状态。

尽管本实验证实痛泻要方治疗IBS肝郁脾虚证大鼠与其调节血清、结肠5-HT的含量有关，但是，由于人体的免疫系统非常强大，简单的一两个指标很难对疾病的发病机制做一个全面的解释，我们下一步计划从5-HT的合成酶色氨酸羟化酶（TPH）和重吸收物质5-羟色胺转运体（SERT）入手，深入全面地探讨5-HT信号系统在肠易激综合征肝郁脾虚证大鼠中的作用。

［1］张璐，段丽萍，刘懿萱，等.中国人群肠易激综合征患病率和相关危险因素的Meta分析［J］.中华内科杂志，2014，53（14）：969-975.

［2］窦志芳，张俊龙，闫川慧，等.肠易激综合征用药规律研究［J］.中华中医药学刊，2012，30（2）：387-392.

［3］蔡俊晏.肠易激综合征（IBS）中医药治疗的文献研究［D］.北京：北京中医药大学，2014.

［4］Wouters M M，Boeckxstaens G E.Neuroimmune mechanisms in functional bowel disorders［J］.Netherlands Journal of Medicine，2011，69（2）：55-61.

［5］尹小君，施茵，赵继梦.从脑－肠轴角度探讨肠易激综合征及其中医治疗［J］.中华中医药学刊，2011，29（10）：2 197-2 201.

［6］王迎寒，刘玉玲，赵素微，等.腹泻型 IBS 脾虚肝郁证候与 5-HT，CRH 的相关性［J］.中国实验方剂学杂志，2017，23（18）：124-129.

［7］赵鲁卿，张声生，卢小芳，等.疏肝健脾方对腹泻型肠易激综合征大鼠的治疗作用及对肥大细胞、5-HT通路的影响［J］.中国中西医结合消化杂志，2017，25（8）：589-594.

［8］陈富丽.痛泻要方治疗IBS肝郁脾虚证5-HT与VIP作用机制研究［D］.太原：山西中医学院，2016.