肖建华 游 艳 董自强

(三峡大学第一临床医学院泌尿外科 三峡大学泌尿外科研究所，湖北 宜昌 443003)

肿瘤致死率高一方面因为多数肿瘤患者早期缺乏典型的临床表现却病程进展迅速，在现有的科学技术水平上不能很好地做到早发现，早诊断和早治疗；另一方面，与目前常用的治疗肿瘤的临床方法有限密切相关。目前临床治疗肿瘤的方法多为以手术为主的综合治疗，多数晚期肿瘤难以根治性切除，且为尽可能治疗彻底，术后往往需要长周期、大剂量的化学药物治疗，常用化疗药物在抑制肿瘤细胞的同时对机体正常细胞也产生了不可逆的损伤，给本身虚弱的身体带来重创，治疗效果普遍欠佳。近些年来涌现出了包括光动力疗法，基因疗法，端粒酶治疗和细菌疗法等多种实验癌症疗法〔1〕。其中，细菌疗法以其选择性肿瘤内复制和积累，携带表达多种治疗性蛋白的能力及能够被抗生素消除等优势成为肿瘤治疗新战略的研究热点〔2〕。本文拟就基于细菌相关特性的抗肿瘤措施研究进展进行综述。

1 肿瘤细菌疗法的发现

有目的地让肿瘤患者感染细菌以治疗肿瘤在很早之前就有报道〔3〕。美国一位医生注意到1例颈部肿瘤患者在感染丹毒后肿瘤逐渐恢复。他开始利用细菌及其毒素治疗终末期肿瘤，并用杀死后的化脓性链球菌和黏质沙雷菌治疗肉瘤、癌、淋巴瘤、黑色素瘤和骨髓瘤，多例恶性肿瘤的进展被明显延迟〔4〕。较大体积的实体肿瘤中心区域氧分压和氧气浓度明显低于正常组织，恰好适应部分厌氧细菌的正常生长，为后续利用细菌作为溶瘤药物提供一定的理论基础。从此，探讨细菌本身及其代谢产物对各类肿瘤的作用，细菌对肿瘤的靶向定植，细菌同传统肿瘤治疗方法的联合引用，细菌作为抗肿瘤药物、细胞因子、基因载体及各类用于肿瘤治疗细菌性能的优化等方面的研究课题不断涌现。

2 细菌本身及其代谢产物的直接抗肿瘤作用

2.1细菌作为肿瘤杀伤剂 正常状态下，人体不同部位均有大量寄生菌存在，这些细菌在从人体吸取营养的同时也发挥着促进人体健康的作用。双歧杆菌、乳酸菌等肠道正常细菌可以促进肠道功能的成熟，帮助消化和吸收，产生维生素，维持能量代谢平衡，调节肠道黏膜免疫系统，防止肠道感染〔5〕，在一定程度上可以抑制肿瘤形成。而且，双歧杆菌、梭状芽孢杆菌等厌氧菌则能够选择性定位于实体肿瘤组织中的低氧浓度和低氧分压环境并迅速繁殖，Fujimori〔6〕在制造肺癌、黑色素瘤和乳腺癌老鼠模型的基础上经鼠尾静脉注射长双歧杆菌一定时间后在每克肿瘤组织中检测出高达6×104CFU细菌量，同一动物的肝肾脾肺等正常组织中细菌数量低于可检测水平；同样，在7，12-二甲基苯并〔a〕蒽(DMBA)诱发的乳腺肿瘤模型中得到了类似的结果，这一特性使得细菌不断以极具潜力的抗肿瘤因子出现。但致病性细菌往往在导致肿瘤缩小的基础上会伴随急性毒性导致肿瘤模型死亡，从而使研究重点集中在了非致病性细菌身上。Yazawa等〔7〕证实在大鼠中诱导的乳腺肿瘤，经尾静脉注射双歧杆菌后，双歧杆菌能特异性地在肿瘤组织中繁殖扩散传播，导致肿瘤组织的萎缩和延长荷瘤大鼠的生存。梭状芽孢杆菌novyi展示出明显的抗肿瘤作用，但致死率也非常高，而经减毒删除编码致死毒素基因后则效果理想〔1〕。VNP20009，删除-msbB和purl-基因后减毒鼠伤寒沙门氏菌菌株的衍生物避免了毒性休克的发生，依赖肿瘤组织嘌呤表现出持久广泛的抗肿瘤功效，甚至能够针对转移病灶，目前已进入Ⅰ期临床试验〔1〕。在美国一项囊括4例黑色素瘤和肾癌的Ⅰ期临床试验中将减毒沙门氏菌VNP20009经静脉注入后在其中3例患者肿瘤组织中检测出细菌〔8〕。细菌除了可以单用作为抗肿瘤措施外还可以其同其他肿瘤治疗方法联合以作为其他抗肿瘤措施的增敏剂。C.novyi NT加单剂量脂质体阿霉素被证实可以根除荷瘤小鼠肿瘤，同时，其同抗微管药物如HTI-286和长春瑞滨组合协助改变肿瘤区域的血供情况以促进治疗药物有效到达目的地或扩大肿瘤组织缺血缺氧区域以利于厌氧菌的繁殖，进一步改善各化疗药物的抗肿瘤效果〔9〕。目前，尚处于研究阶段的新型抗肿瘤细菌菌株还包括猪霍乱沙门菌，霍乱弧菌，李斯特菌和大肠杆菌等。

2.2细菌孢子 大多数厌氧菌均可以形成孢子，且一旦他们遇上有利的条件，如肿瘤内部的坏死区，孢子便可以发芽茁壮成长，同样其被研究用于肿瘤靶向治疗，且将部分孢子进行基因修饰后还可避免过多的毒副作用。小鼠肿瘤模型瘤内注射C.histolyticum和C.sporogenes孢子后可以明显观察到肿瘤组织的崩解。重组后的梭状芽孢杆菌孢子免疫原性低，并不引发免疫反应，4次重复注射11 d后仍然可以显示出明显的抗肿瘤活性〔10〕。C.novyi NT孢子同传统的化疗药物如海兔毒素-10，丝裂霉素C，长春瑞滨和多西紫杉醇的组合同样显示出协同抗肿瘤特性。此外，肿瘤的动物模型实验还证实细菌孢子可以增强放射疗法，放射免疫疗法的疗效〔11〕。此外，细菌孢子也有被研究作为抗肿瘤药物、细胞毒性肽，治疗性蛋白质的传递系统和基因疗法的载体。

2.3细菌毒素 细菌毒素可以杀死细胞或调节细胞的代谢过程如增殖、凋亡和分化等，同样具有一定的抗肿瘤活性，可用于肿瘤治疗或以其为基础研制用于肿瘤治疗的免疫毒素〔12〕。白喉毒素(DT)可以结合到表达肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)前体的细胞表面并通过网格蛋白小泡内吞而被吸收介导具有催化活性的白喉毒素片段A生成，进一步催化延伸因子(EF)-2导致蛋白质合成受抑制，继发细胞裂解和(或)诱导细胞凋亡。同样，绿脓杆菌外毒素A通过该通路导致蛋白质合成受抑制，发挥抗肿瘤作用，使其成为潜在的肿瘤靶向治疗候选措施〔13〕。产气荚膜梭菌A型菌株产物肠毒素(CPE)纯化后可对胰腺癌、结肠癌、乳腺癌和胃癌细胞产生急性细胞毒作用，导致肿瘤坏死，抑制体内肿瘤的生长〔14，15〕。黄色葡萄球菌α-毒素，百日咳杆菌AC毒素，志贺样毒素，霍乱毒素分别作用于间皮瘤细胞(P31)和小细胞肺癌细胞(U-1690)的初步结果表明增加毒素剂量则细胞毒性相应增加，毒素可以明显增加肿瘤细胞凋亡的发生〔16〕。为了避免绿脓杆菌外毒素、DT等本身的高毒性，常将其结合到一些共轭细胞结合蛋白或通过转基因或重组毒素，删除或替换编码毒素结合区的核酸以提高其对肿瘤细胞的选择性，降低对正常细胞的损伤。共轭结合有白细胞介素(IL)、粒细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子、转铁蛋白、表皮生长因子等的细菌毒素已逐渐进入临床试验阶段，具有一定的研发前景。重组IL4-绿脓杆菌外毒素(IL-4-PE)在裸鼠体内实验中已经证明对人脑胶质瘤肿瘤模型具有显著的抗肿瘤活性。瘤内给药IL-4-PE用于治疗恶性星形细胞瘤目前正已进入Ⅰ期临床试验〔17〕。另外，细菌毒素还可以增加肿瘤细胞对其他抗肿瘤疗法的敏感性，如肉毒杆菌毒素可通过促进肿瘤血管开放而使癌细胞对放疗和化疗更有效。

3 细菌介导的肿瘤免疫治疗

肿瘤生长于机体，同样接受全身免疫系统的监视，但可能由于其免疫原性过弱导致其被机体当做自身抗原逃避免疫系统的破坏，试想如能利用可行的刺激增加肿瘤细胞的免疫原性，激活自身免疫系统对其排斥和杀伤或许可以起到很好的抗肿瘤效果。因此，基于细菌相关特性的肿瘤免疫疗法逐渐兴起。减毒S.鼠伤寒沙门菌仍具侵入性，体内外均可感染恶性细胞并触发免疫反应，表达小鼠细胞因子基因工程减毒菌株可显著调节感染免疫力，滞后黑色素瘤的生长能力〔18〕。一种携带编码人类肿瘤血管内皮标记物(TEM)8异种核酸疫苗的减毒鼠伤寒沙门菌口服后可诱导TEM8特异性CD8毒性T细胞反应，抑制肿瘤血管生成，发挥抗瘤作用〔19〕。C.novyi-NT孢子单独作用后可诱导大量白细胞聚集，产生IL-6等细胞因子，引发炎症反应，通过生成的活性氧，蛋白酶及其他降解酶直接对肿瘤细胞构成破坏，同时还可启动强有力的细胞免疫反应破坏残余的肿瘤细胞；同其他药物如抗微管剂结合也表现出协同的抗肿瘤作用〔20〕。此外，经相应处理后的细菌可用于传递肿瘤疫苗，重组李斯特菌单核细胞疫苗株(LM-NP)在临床前期已显示出强大的抗肿瘤效能；另有研究表明重组李斯特菌菌株LM-LLO-E7可以有效治疗多数荷瘤小鼠，且LM-LLO-E7作为宫颈癌免疫治疗的研究已进入临床试验阶段〔21〕。结核分枝杆菌的细胞壁骨架牛卡介苗(BCG-CWS)已经作为一种有效的佐剂用于各种癌症患者的免疫治疗，在结肠癌细胞中表现出明显的放射增敏作用〔22〕，这些研究结果均表明了非剧毒细菌作为肿瘤免疫治疗剂的巨大潜能。

4 细菌作为传递系统

缺氧和坏死是大多原发或转移性实体肿瘤的典型特征，应用氧电极测试肿瘤组织中氧分压的中位数10～30 mmHg，很多区域读数甚至低于2.5 mmHg，而正常组织中氧分压24～66 mmHg〔23〕，如此一来，科研者们便尝试利用非致病性专性或兼性厌氧细菌来选择性识别肿瘤组织中的厌氧条件，Kimura等〔23〕将双歧杆菌经尾静脉注入荷瘤小鼠体内后反复观察到细菌在48～96 h内从正常组织和器官中消失，而仅在肿瘤组织中生长。这样就使得一些厌氧细菌，如梭状芽胞杆菌，营养缺陷型细菌，如沙门菌，被研究作为肿瘤治疗措施中的递送载体。

4.1酶前体药物治疗 Fujimori〔6〕构建能够表达胞嘧啶脱氨酶的质粒pBLES100-S-eCD并经长双歧杆菌靶向导入实体肿瘤组织中，然后为转移性乳腺癌患者大剂量全身应用较5-氟尿嘧啶毒性低的5-氟胞嘧啶，从而使胞嘧啶向尿嘧啶的转化仅仅发生于有胞嘧啶脱氨酶生成的实体肿瘤组织中而避免高浓度的5-氟尿嘧啶分布到正常组织中以克服化疗毒副作用，同样的处理系统在多种免疫缺陷裸鼠体内移植的人类肿瘤中均已被成功确认有效。Fox等〔24〕通过实验证实其设计的丙酮丁醇梭状芽孢杆菌同样为非常有效的酶前体药物治疗措施，且其表达效果在血管靶向剂考布他汀A-4磷酸的作用下显著增强，同样，沙门菌也被结合了硝基还原酶和胞嘧啶脱氨酶并证实抗肿瘤效果确切。表达大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶的鼠伤寒沙门菌体可选择性将抗肿瘤药物导向固体肿瘤发挥抗肿瘤作用，且其活性较前体药物联合更昔洛韦更高。沙门菌还可与一种将芥菜前体药物转化为核酸交联剂的酶，羧肽酶(CP)G2结合，体内用药后肿瘤中可检出高度活性〔25〕。在一项临床试验中将携带胞嘧啶脱氨酶的减毒沙门菌VNP20009直接接种到难治性肿瘤瘤内同时口服化疗药物5-氟胞嘧啶，可抑制38%～79%的肿瘤增长效应且细菌并不在身体中播散〔26〕。

4.2基因治疗 候选治疗基因导入细菌后选择性在肿瘤细胞间繁殖，此时，治疗基因并未导入肿瘤细胞，只是其编码产物-治疗性蛋白产生并释放于肿瘤细胞中发挥其抗肿瘤作用〔27〕。将厌氧婴儿双歧杆菌介导的胸苷激酶(BI-TK)自杀基因治疗系统应用于N-甲基-亚硝基脲灌注法诱导的大鼠膀胱肿瘤模型后成功发现用BI-TK/GCV治疗组的caspase-3凋亡蛋白表达水平和肿瘤细胞凋亡率明显高于空质粒组和生理盐水组，膀胱肿瘤负担则显著低于生理盐水对照组〔28〕。人(h)IL-12，人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)，鼠(m)IL-12和鼠(m)GM-CSF基因被克隆到营养缺陷型鼠伤寒沙门菌SL3261上，其表达受巨细胞病毒(CMV)启动子控制，研究证实口服表达mGM-CSF或mGM-CSF加mIL-12的沙门菌可以引起Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤消退。传递表达IL-2基因的鼠伤寒沙门菌、表达肿瘤坏死因子的VNP20009和丙酮丁醇梭菌和作为抗血管生成蛋白内皮抑素的传递系统逐渐被纳入研究以验证不同细菌作为基因治疗载体的可行性〔29〕。姜宏华等〔30〕通过实验验证了经基因改造的大肠杆菌DH5对裸鼠结肠癌肝转移的治疗效果由双歧杆菌细菌传递shRNA的系统〔31〕也已被考虑，但是，有效向癌细胞转移shRNA的装置仍然需要进一步研究。

此外，Liu等〔32〕还通过工程腺病毒载体改变了细菌的感染去向后使用在肿瘤表面存在特有配体的阳离子脂质体和不明机制却可以在肿瘤中优先积累的活减毒沙门菌克服了治疗基因在原发肿瘤组织中分布不均和转移灶过多而无法一一注射的问题。

综上，借助于肿瘤组织中的缺氧区域使厌氧细菌选择性集中生长而发挥作用，这就要求肿瘤组织中存在足量的坏死区域。而早期的原发瘤灶或远处转移瘤往往体积小，血供较丰富，难以实现细菌介导的针对性治疗。同时，较大体积的肿瘤组织仅中心区域缺氧、坏死较重，同正常组织交界区血供常相对充分，基于细菌措施不可能实现完整的肿瘤溶解。再者，难以确定全身应用的细菌剂量，增大剂量则容易导致感染性疾病或其他毒性反应，减小剂量则致药效减弱，不能达到理想的治疗效果。因此，即使后续的大规模多中心研究证实上述各项措施效果确切，安全可靠且临床可行性强，单独应用多不能实现理想效果，需进一步探究各措施同传统肿瘤治疗措施的联合应用、新的改进方案或抗肿瘤措施，以期更好地控制药物剂量、施药方法、毒副反应和治疗效果。

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