郭建路 康品方 陶 敏 唐 碧

(蚌埠医学院第一附属医院心血管科，安徽 蚌埠 233004)

钙调神经磷酸酶(CaN)-T细胞活化核因子(NFAT)3在心血管系统表达丰富,在心血管疾病发生发展中发挥重要作用〔1〕,关于CaN/NFAT3信号通路在心肌损伤过程中作用机制的研究愈发明确。本文对CaN/NFAT3信号通路与心血管疾病研究进展进行综述。

1 CaN

CaN是普遍存在的丝氨酸/苏氨酸磷酸化酶家族中一员，钙调神经磷酸酶全酶是一种异源二聚体，包含与钙调蛋白结合的催化亚基CnA(61 kDa)和与Ca2+结合的调节亚基CnB(19 kDa)。CnA包含N末端的催化区域，CnB结合区域，钙调蛋白结合区和C末端自身抑制区域(AID)。在哺乳动物中，CnA由三个基因编码，分别为CnAα、CnAβ、CnAγ，但只有CnAα(PPP3CA)和CnAβ(PPP3CB)在哺乳动物心脏中表达；CnB分别由CnBα和CnBβ编码，只有CnBα在心脏中表达〔2〕。CaN参与调控的信号通路有经典的NFATc信号途径，在CaN的催化下NFATc脱磷酸化进入细胞核内，并与转录因子如GATA4共同参与下调控基因转录。然而在细胞核中，CaN则通过抑制输出蛋白 Crm1与NFATc的结合〔3〕，使NFATc能够在核内持续积累而发挥作用。除了经典的NFATc外CaN下游的效应分子还有MEF2〔4〕,后者存在于骨骼肌、神经及淋巴细胞中。有研究发现RTA2作为CaN下游的另一个效应分子在内质网应激反应中发挥重要作用〔5〕。

2 NFATc

NFATc家族是Ca2+/CaN依赖的一类转录因子，包括：NFATc1(NFAT2)、NFATc2(NFAT1)、NFATc3(NFAT4)、NFATc4(NFAT3)和NFAT5〔6〕，除了NFAT5的激活依赖于渗透压改变之外〔7〕，其他成员是最具特异性的CaN下游活化因子，并且其对于CaN功能的发挥是必不可少的。CaN调控NFAT蛋白的保守性区域包含了两个串联结合域：①调节区域：也叫NFAT异体同形域(NHR)；②DNA结合域。其中调节区域在细胞静止状态下处于高度磷酸化状态，因此NFAT在细胞静止状态时被限制在细胞质中，不能进入细胞核。NFAT起初是在活化T细胞核中发现的，是细胞因子表达的重要诱导因子〔8〕。此后，NFAT蛋白已被证明在免疫细胞中扮演不同的角色，包括心血管系统〔9〕，进一步研究发现NFAT广泛分布于各组织。NFATc是一种普遍存在的转录因子，可转录诸多细胞因子包括白细胞介素(IL)-2、IL-3、IL-4、IL-12，炎症细胞因子与生长因子〔10〕。进一步研究发现，分别应用CaN 和 NFAT的特异性抑制剂CsA 和A-285222，或应用基因干扰技术使NFAT基因沉默均可有效抑制高糖环境引起的心血管损伤〔11〕。在心肌纤维化过程中NFAT作为重要的介导信号分子发挥重要作用〔12〕。

3 Ca2+-CaN-NFATc信号通路的激活

Ca2+/钙调素(CaM)-CaN-NFATc 组成钙调神经磷酸酶信号通路。在静止细胞中处于高度磷酸化状态的NFAT蛋白存在于胞质中，对DNA亲和力低；NFATc信号通路的激活与游离Ca2+水平升高密切相关〔13〕，游离Ca2+水平升高，结合CaM共同作用于CaN A亚基使之活化，CaN使NFAT脱磷酸化激活，活化的NFAT蛋白能在核内保持长时间的活化状态。处于脱磷酸化状态的NFAT蛋白对DNA亲和力增高从而促使靶基因转录。而钙离子通道的激活离不开磷脂酶(PL)C-γ，活化的PLC-γ作用于二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2),使PIP2降解为三磷酸肌醇(IP3)和二酰甘油(DAG),IP3进而激活钙通道，因此NFATc信号通路的激活与PLC-γ密切相关。

4 Ca2+-CaN-NFATc4信号通路与心肌肥大

心肌肥大是一种受病理性刺激后的代偿性反应，以此来保持心脏的收缩性和正常的心脏功能。但是，过度心肌肥大可能导致非适应性的结构和功能的重构，进而引起诸如心律失常，猝死，甚至心力衰竭。心肌肥大是心力衰竭发展过程中临床早期的一个标志，并且受多种信号通路调控。在心肌组织中主要表现为细胞表面积和蛋白合成的增加，以及一些胎儿基因的表达，如β-主要组织相溶性复合体(MHC)、人心钠素(ANF)、脑钠肽(BNP)等〔14〕。近年来研究发现CaN/NFATc4 信号通路在心肌肥大过程中发挥重要作用〔15～17〕。CaN/NFATc4信号通路在内皮肽-1诱导的心肌肥大过程中起到肥大性信号作用，当NFATc4被CaN脱磷酸化后，即会转入细胞核内对β-MHC、ANF、BNP肥大基因的表达进行调控〔14〕。在对重组人小泛素相关修饰物(SUMO)2的研究中发现其在心肌肥大中有重要作用，SUMO2能够增加NFATc的活化程度，诱导肥大相关基因表达，进而使细胞肥大;并且这种现象在离体和在体实验两种情况下都能够出现，可能机制：SUMO2可以通过非依赖性的类泛素化修饰作用与CaN直接发生反应，进而促进后者转移到细胞核内;同时内源性SUMO2可以活化CaN-NFAT信号通路〔18〕。

Guan等〔19〕研究发现CD38 基因敲除的细胞在血管紧张素(Ang)-Ⅱ刺激后，细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)和蛋白激酶B(AKT1)的磷酸化水平明显衰弱。在CD38基因被敲除后，Ca2+信号分子cADPR数量明显减少，提示CD38在Ca2+/CaN/NFAT 信号通路中扮演重要角色。另外，当把H9C2细胞的CD38基因敲除后，肥大相关信号AKT的下游效应分子GSK-3β的表达受到抑制。一般情况下GSK-3β处于非磷酸化的活化状态，而当肥大刺激存在时，GSK-3β第九位氨基酸丝氨酸被磷酸化，随之处于静止状态。GSK-3β的上游调控通路如：磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/AKT、ERK激酶(MEK)/ERK1/2都可以通过磷酸化GSK-3β的丝氨酸磷酸化位点来调控GSK-3β的活性〔20〕。当使用GSK-3β抑制剂1-Azk或使用siRNA干扰时，使用心肌细胞肥大性刺激后心肌细胞表面积有所增加，而当GSK-3β激活后，可有效缓解心肌细胞肥大，说明GSK-3β在心肌细胞肥大过程中起到保护性作用。GSK-3β可以通过调节NFATc4的N末端保守序列的磷酸化使其从细胞核转出回到胞质中。以上说明NFAT信号可以作为刺激信号的下游效应分子在心肌肥大性反应中发挥调节作用。

5 Ca2+-CaN-NFATc4信号通路与心肌纤维化(MF)

MF是多种心脏疾病发展到一定阶段的共同病理改变，是心肌重构的主要表现之一，其变化存在于多种心血管疾病中，与心律失常、 心力衰竭等密切相关。所以预防和及时改善MF是降低心血管疾病死亡率重要措施。MF是以成纤维细胞产生的细胞外基质过量堆积和其本身表型改变分化成纤维母细胞为主要特点的一种病理现象〔21〕。MF是十分复杂的病理过程，可能有多信号通路介导。羟脯氨酸作为胶原代谢和产生的指示剂已得到广泛应用，目前研究发现通过抑制CaN途径可有效消除由去氧肾上腺素诱导的羟脯氨酸堆积和NFAT的核内转移〔22〕，提示CaN途径在细胞外基质的调控过程中发挥重要作用；而胶原又是心肌细胞纤维化过程中产生的细胞外基质重要成分，这表明CaN途径在MF过程中有重要意义。Herum等〔23〕对多配体蛋白聚糖-4介导的机械压力负荷性MF的研究中发现：当心脏成纤维细胞受到机械性压力负荷时，多配体蛋白聚糖-4会通过激活CaN途径，增加胶原Ⅰ、胶原Ⅲ mRNA水平，同时平滑肌肌动蛋白(SMA)水平和纤维组织也有所增加〔23〕。因此阻断多配体蛋白聚糖-4胞内段与CaN之间的相互作用进而抑制其下游效应分子NFAT诱导的基因转录，可能有效减弱压力负荷性MF水平。钙信号对激活一些钙敏感性酶如蛋白激酶C、钙调蛋白依赖性激酶Ⅱ和CaN是必不可少的。磷脂酶C活化可催化PIP2产生IP3和DAG。IP3与内质网上的受体结合，释放钙离子。活化的CaN使NFAT活化进入细胞核内激活其应答基因〔24〕。

腺苷是普遍存在的嘌呤核苷，它的存在对细胞功能的调控有重要作用。在心血管系统中腺苷呈现出丰富功能：冠状动脉扩张、心率控制、房室节律、心肌肥大和MF等方面。腺苷通过与其位于胞膜外受体(AR1、AR2A、AR2B、AR3)结合，AR胞内段再与G蛋白耦联作用激活下游一系列级联反应;腺苷酸环化酶(AC)和PLC被激活，分别活化下游环磷酸腺苷(cAMP)和PIP2。激活不同腺苷受体在MF方面有不同作用〔25〕。AR2A受体活化有抗纤维化作用〔26〕，PI3K激活并进入细胞核抑制促纤维化基因表达，降低胶原产生;而另外三种腺苷受体则可能表现为促MF作用，其中AR1、AR3通过抑制腺苷酸环化酶进而抑制PI3K，AR2B则通过使PIP2活化产生IP3和DAG，进一步使钙通道活化释放钙离子。钙离子释放使钙依赖性酶CaN激活，进而使CaN/NFATc信号通路活化。由此可见，活化的腺苷受体可能通过CaN途径激活促纤维化基因的表达,但具体机制需进一步研究证明。

6 Ca2+-CaN-NFATc信号通路与冠心病

冠心病是动脉粥样硬化导致器官病变最常见类型，也是严重危害人类健康的常见病。报道表明CaN/NFATc信号通路在冠状动脉平滑肌细胞和血管壁形成中有重要作用〔27〕，通过染色质免疫沉淀技术(ChIP)检测出NFATc4可以促进Smad2 转录，后者作为转化生长因子(TGF)-β下游信号的重要转导分子，当TGF-β与其受体结合后招募smad蛋白并使其进入细胞核内转录平滑肌增殖分化基因，促进冠状动脉管壁形成。内皮损伤反应学说认为冠状动脉粥样硬化各种主要危险因素最终都损伤动脉内膜，而粥样硬化病变的形成是动脉对内皮、内膜损伤做出的炎症-纤维增生性反应的结果。目前认为氧化低密度脂蛋白(oxLDL)是最重要的致粥样硬化因子，是损伤内皮细胞和平滑肌细胞的主要因子。在Bear等〔28〕研究中发现oxLDL能够协同β-磷酸甘油共同促进原代培养的动脉平滑肌细胞表达成骨细胞分化转录因子Osx并向成骨细胞分化，并提出在机体内oxLDL可以促进成骨细胞分化和血管钙化。有研究显示NFAT信号在介导oxLDL损伤血管平滑肌过程中起重要作用〔29〕，NFAT信号可以介导经oxLDL诱导的血管平滑肌钙化和向骨母样细胞转化，而二者均为动脉粥样硬化过程中重要的一部分,然而研究只涉及NFATc1和NFATc2两种因子，至于NFATc4(NFAT3)是否存在类似的作用尚无明确证据报道，但是NFAT3在心血管系统中有丰富表达，不难预测NFAT3在介导oxLDL诱导的动脉粥样硬化过程中发挥作用，但仍需进一步实验研究证明。

综上，CaN/NFAT3信号通路在心血管系统疾病发生发展中扮演重要角色，其可参与调控心肌肥大、MF等过程，在冠心病进程中也有调控作用；虽然NFAT3信号在心血管系统中作用得到肯定，但是其具体机制还有待进一步阐明，这对于针对其特异性药物的应用意义重大。钙信号特异性阻断药物在临床应用常见，但这势必会产生一些副作用，NFAT3信号作为钙信号的下游重要成分发挥作用，针对其特异性阻断药物在临床应用少见报道，未来应着眼于明确NFAT3信号在心血管系统中作用机制研究，并进一步探索其可能存在的下游分子，进而研制出更为精确的靶向药物。