王欢，江莉

精子发生是一个复杂的多因素调控过程，二倍体的精原细胞经过一系列生化、生理和形态学的改变，形成单倍体精子。染色体异常、基因调控异常，环境因素、感染因素、免疫因素、内分泌失调，以及其他疾病如精索静脉曲张、输精管阻塞、抗精子抗体、隐睾症、逆行射精、睾丸癌、继发睾丸创伤等，可导致精子发生障碍从而引起男性不育。其中，弱精子症是最常见的男性不育症类型，指精液中前向运动的精子数量（A类和B类）低于50%或快速直线前向运动的精子数量低于25%的病症，主要特征表现为精子活力差，前向运动能力低。约70%的不育男性存在不同程度的弱精子症［1］，至今对其发病机制尚未能确切阐明。目前普遍认为，基因调控异常是弱精子症发病的中心环节。近年来，微小RNA（microRNA，miRNA）功能的研究正在不断深入，其主要研究热点包括细胞的增殖分化和凋亡、胚胎发育、癌症发生和恶变、病毒感染等。在男性不育研究领域，研究者们一致认为，miRNA通过调控其特异的靶基因转录和翻译而影响精子发生过程。在此，本文对miRNA在弱精子症发病机制中参与调控作用的研究进行综述。

1 睾丸组织中的miRNA

miRNA是单链、内源性的非编码小分子RNA，长度为22～24个核苷酸。miRNA基因在细胞核内通过RNA聚合酶Ⅱ转录产生初始转录本，即pri-miRNA，然后在Drosha RNase酶的作用下剪切为60～70 bp的miRNA前体（pre-miRNA），pre-miRNA通过核内的转运蛋白Exportin-5转运到细胞质中，再由Dicer进一步剪切成为成熟的miRNA。这些成熟的miRNA与靶向mRNA的3'非编码区（3'UTR）碱基互补配对，在转录后对基因的表达进行负向调控，从而引起靶向mRNA的降解或翻译抑制［2］。miRNA主要是对内源性mRNA进行修饰，并且在表达上具有发育时序性和组织特异性，参与细胞的生长、增殖和凋亡等过程。

miRNA在哺乳动物的睾丸、附睾、精原细胞、精子和精浆中广泛表达［3］。2013年，YANG等［4］首次用Solexa高通量测序技术检测人类睾丸miRNA，发现770个已知的miRNA和5个新的miRNA。采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）对这些miRNA进行验证，结果表明，检测到的miRNA在人睾丸中均有表达，以let-7家族的表达最为明显，其中let-7f-5p、let-7a-5p、let-7c、let-7b-5p、let-7g-5p的表达最为丰富。

miRNA在灵长类动物的成熟和未成熟睾丸组织存在差异表达。部分miRNA在灵长类动物未成熟睾丸组织中高度表达，而在成熟睾丸组织中不表达［5］，如hsa-miR-154；而有些miRNA在灵长类动物成熟睾丸组织中高表达，而在未成熟睾丸组织中不表达，如hsa-miR-34b、hsa-miR-34c、hsamiR-449、has-miR-124a、hsa-miR-449 等。

LUO等［3］通过高通量测序比较长白公猪精子发生的3个主要阶段的miRNA表达谱，分别构建了睾丸、附睾和精子3个小RNA文库，共获得3 821个编码4 761个成熟miRNA的前体发夹结构，其中有23个miRNA*。3个文库中共同表达的miRNA有710个，而764个（16.05%）miRNA在睾丸特异表达，1 416个（29.74%）miRNA在附睾特异表达，784个（16.47%）miRNA在精子特异表达。检测到的4 761个miRNA中，有1 447个是5'链miRNA，1 434个是3'链miRNA，其余1 880个（940对）miRNA是姐妹链，这些成对的姐妹链来自相同的前体，占总成熟序列miRNA的1/3，而且同对姐妹链之间相互独立，具有各自的阶段特异性表达。该研究证实了miRNA及其对应的miRNA*来自同一前体，这是miRNA在睾丸表达的特征。由此可见，miRNA在睾丸组织及其不同发育阶段的表达存在特异性，说明miRNA对精子发生、发育有着不可或缺的作用。

2 miRNA与精子发生

与体细胞相比，miRNA在原始生殖细胞（primordial germ cells，PGCs）、精原干细胞（spermatogonial stem cell，SSCs）和精原细胞中有更高的表达水平［6-7］。因此，miRNA被认为是生殖细胞发育的强有力调节器。哺乳动物的PGCs来源于胚胎外胚层，人类PGCs可能在原肠胚时期（约第17天的胚胎）形成。在4周时，原始生殖细胞位于邻近卵黄囊壁靠尿囊处，通过后肠迁移到生殖嵴（胚胎性腺）［8］，并随着性腺的不断分化而迅速增殖。因而，PGCs是各型生殖细胞的祖细胞，是哺乳动物生命周期得以延续的关键第一步。目前明确在PGCs特异表达的有miR-290-295、miR-17-92基因簇和miR-302家族等，miR-302家族包括miR-302a-3p/-5p、miR-302d-3p、miR-302c-3p，其已验证的靶基因是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A（CDKN1A）［7］。精子发生的持续进行依赖于小亚群未分化的具有干细胞功能的精原细胞，即SSCs。有研究发现，miR-20、miR-21、miR-34c、miR-135a、miR-146a、miR-182、miR-183、miR-221/222、miR-204、miR-465a-3p、miR-465b-3p、miR-465c-3p、miR-465c-5p、miR-544在 人SSCs特异表达，参与调控SSCs的自我更新和分化［9］。转染miR-221/222抑制物后，小鼠未分化的SSCs池数量下降，引起与生殖细胞衰老相关的功能障碍，但不引起细胞凋亡［10］。HUSZAR等［11］研究miRNA介导的基因调控在维持精原细胞未分化状态及其诱导分化的作用，发现miR-146在未分化的精原细胞中高表达，参与调控维甲酸诱导的小鼠精原细胞分化，其中一部分由Med1（维甲酸受体的辅调节因子）介导。miR-17-92基因簇是含有共同miRNA位点的4个不同miRNA家 族（miR-17、miR-18、miR-19、miR-25）， 可 能 参 与SSCs的早期分化，也在未分化的精原细胞中表达，在分化过程中表达下调。miR-17-92基因簇能下调E2F1基因，避免精子发生过程中减数分裂的细胞凋亡。DDX4 Cre诱导miR-17-92基因簇使生殖功能障碍，睾丸体积减小和质量减轻［12］。敲除miR-17-92基因簇的成年小鼠出现生殖功能障碍和异常的睾丸表型（如睾丸严重萎缩，精原细胞、SSCs丢失，生殖细胞凋亡和精子生成减少）［13］。

在精子发生的不同细胞阶段，miRNA的表达也有所不同。从睾丸组织分离的细胞群，如支持细胞、精原细胞、粗线期精母细胞、圆形/长形精子细胞和精子，有28种睾丸特异miRNA共同表达，表明在精子发生过程中减数分裂后期和单倍体生殖细胞是miRNA产生的主要来源［14］。COMAZZETTO等［15］探讨了miRNA通路在精子发生有丝分裂后期的作用，发现Dicer酶的表达在粗线期精母细胞达到最大值。越来越多关于Dicer酶与生殖细胞的研究也证实了miRNA对精子发生调控信号的重要性［16］。敲除Dicer的睾丸组织处于细胞增殖和/或分化的早期阶段，延缓了精子发生过程，同时干扰miRNA的正常机制，长形精子细胞形态和活力发生异常［16-17］。

目前研究较多的是miR-34家族，该家族的miRNA有共同的种子序列GGCAGUG，在雄性生殖细胞特异表达，是生殖细胞进行减数分裂所必需。HILZ等［18］研究确定了miR-34b/c是哺乳动物精子发生所需的第1个miRNA位点。随着减数分裂的开始，miR-34家族的表达也急剧增加。敲除miR-34家族基因的小鼠可导致不育，此外，这些小鼠很少能产生成熟的精子。miR-34b/c的缺失并没有阻止精子发生本身，但干扰了正常发育阶段之间的转换，最终导致精子计数低、精子形态畸形和活力异常。miR-34c主要在减数分裂的后期形成，参与精子发生。miR-34c的靶基因TGIF2，其下调后促进TGFB信号转导通路，而该通路参与了精子发生过程中粗线期精母细胞和圆形精子细胞的形成［19］。除了miR-34家族，miR-29家族是第2个发现的在精子发生过程也有重要作用的miRNA家族，且miR-29家族参与生殖细胞减数分裂前和减数分裂时的转录调控作用比miR-34家族介导得更为广泛。miR-29家族可能在减数分裂过程中主要对双链DNA断裂进行修复，此外还能调节多种细胞外基质成分，对生殖细胞基底膜动力学发挥一定作用［20］。

精子发生过程中基因表达的转录后调控是极其活跃的，表明miRNA-mRNA调控网在精子发生翻译水平中发挥了潜在作用。miRNA介导过渡蛋白（TPs）和鱼精蛋白（PRM）翻译水平的调控，而TPs和PRM表达的正确时机是晚期精子发生中组蛋白-PRM成功转型的关键。TP2和PRM2 mRNA是睾丸特异miR-469的靶基因，miR-469抑制粗线期精母细胞和圆形精子细胞TP2和PRM2蛋白的表达，在翻译水平对mRNA的降解有轻微影响［21］。PLCXD3蛋白在人和小鼠中呈组织特异性表达，在精子发生后期，miR-34c-3p能降低PLCXD3翻译水平，导致睾丸功能障碍［22］。

3 miRNA与弱精子症

越来越多的研究表明，正常的精子发生与生精障碍的miRNA具有不同的表达模式，这些差异表达的miRNA可为明确弱精子症的发病机制提供依据，也可作为诊断弱精子症新的生物标志物基础。2013年ABU-HALIMA等［23］通过高通量miRNA微阵列平台分别检测弱精子症、少弱精子症患者和正常组精液，与正常组比较发现，弱精子症组有50个miRNA表达上调，27个miRNA表达下调，其中miR-30a、miR-24、miR-1274a和miR-4286差异显著；少弱精子症组有42个miRNA表达上调，44个miRNA表达下调，其中miR-200c、miR-34b*、miR-15b、miR-34c-5p、miR-449a、miR-16 和miR-19a差异显著。弱精子症组和少弱精子症组有34个miRNA共同表达，包括27个miRNA表达上调和7个miRNA表达下调，其中miR-141、miR-193b、miR-26a、miR-29a、miR-429、miR-200a、miR-99a、miR-363、miR-34b、miR-197和miR-122表达差异显著。2016年ABU-HALIMA等［24］研究发现，与正常组精浆比较，少弱精子症患者有36个miRNA表达显著差异，其中7个miRNA表达上调，以miR-1275表达最显著；29个miRNA表达下调，以miR-26b表达最显著。

弱精子症以新鲜精液中精子前向运动能力低和精子活力差为特点。正常情况下，精子活力是在附睾获得的，是精子从阴道迁移到输卵管、穿透卵丘、参与受精的重要动力。在维持人类精子活力的过程中，线粒体在提供能量方面起着举足轻重的作用［25］。而miRNA介导的基因表达是调控线粒体功能的重要机制之一。线粒体相关的miRNA为线粒体功能潜在的调控因子，这些miRNA由核基因组和线粒体基因组编码，可以调节核基因编码的线粒体相关蛋白，也可以转运到线粒体中，从而调控线粒体基因表达，参与多种疾病的发生。在男性不育方面，精浆中线粒体相关miRNA，即sp-miRNA（seminal plasma miRNA）在弱精子症中起着重要作用。ZHOU等［26］通过汇集TLDA芯片检测严重弱精子症患者精液，发现136个sp-miRNA表达显著改变，同时筛选出与线粒体功能密切相关的18个miRNA，通过实时荧光定量反转录聚合酶链反应（qTR-PCR）验证发现，弱精子症组精浆中miR-151a-5p明显过表达，而miR-101-3p、let-7b-5p明显低表达。转染了miR-151a-5p模拟物的GC-2细胞，其基础呼吸耗氧率、三磷腺苷（ATP）产生和质子渗漏均显著下降，表明miR-151a-5p的过表达能诱导细胞线粒体功能障碍，降低线粒体电子传递链的活动，从而影响精子活力。

miRNA的调控作用贯穿到精子发生、发育和成熟的整个过程。这些过程需要一个精准的、具有空间性和时间性的基因调控表达模式。目前已经发现了一些参与精子活力的基因， 如 Tektin-t（Tektin-2）、DNAI1、DNAH5、DNAH11、AKAP3、AKAP4、SEPT4、SMCP、SEMG1、CRISP2 等。CRISP2是精子顶体和精子尾部外致密纤维的组成部分，其可以调节精子鞭毛运动，在顶体反应过程中从顶体释放出来［27］。弱精子症患者多有CRISP2低表达或miR-27b的过表达，出现精子活力低下和精子形态异常的趋势［28］。miR-27b主要通过调控转录后水平抑制CRISP2蛋白表达，影响精子活力。而miR-27a在弱畸精症患者中高度表达，主要通过抑制同一靶基因CRISP2影响精子形态，导致精子畸形［29］。

4 结论和展望

近年来，人们对miRNA在睾丸组织的广泛表达及其在精子发生中参与基因表达的调控功能有了越来越多的认识。一些miRNA特异表达于睾丸组织，在其他组织中不存在，且其表达具有时序特异性和细胞特异性。一个miRNA可能有多个靶基因，或者一个基因受多个不同miRNA的调控。在体内外诸多因素的干扰下，一旦miRNA-mRNA这个复杂的调控网发生改变，就会阻碍精子发生的有序进行，从而导致男性不育。目前对miRNA参与生殖细胞增殖、分化和凋亡的调控作用的研究主要集中在精子发生的中晚期阶段，而对精子发生早期阶段的miRNA研究仍较少，尤其是从精母细胞到精原细胞的过程。弱精子症作为男性不育最常见的疾病，阐明其发病机制和提供诊治新策略是首要解决的问题。随着研究的不断展开，miRNA在弱精子症的表达及其靶基因潜在调控作用的研究逐渐深入，miRNA可能有望成为诊断弱精子症和研发新药的新型生物标志物，对生殖医学领域具有重要意义。

本文文献检索策略：

（1）检索数据库：PubMed、中国知网、万方数据知识服务平台；（2）检索词：microRNA、miRNA、asthenozoospermia、spermatogenesis、male infertility、弱精子症、男性不育、精子发生、精原细胞、精原干细胞；（3）时间限制：2000年1月—2017年7月。

作者贡献：王欢进行文章的构思与设计、可行性分析，进行文献/资料收集、整理，撰写论文；江莉进行论文的修订，负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。

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