黄景南 张曌楠 和静芳 李志国 朱雅楠 余岢骏 苏松坤

（福建农林大学蜂学学院，福州 350002）

引言

20世纪中叶开始，神经系统的研究地位从以往生物与心理学研究的边缘迅速跃升，成为神经科学这一交叉学科。这一新兴的学科促使生物化学、精神病学、解剖学、神经病学、心理学、细胞生物学和生理学等不同研究背景的科研工作者开始合作，探索脑科学的奥秘[1]。微电极发明虽然可以记录单个细胞的电活动，但是很难甄别其生物化学特性。20世纪60年代中期，Falck-Hillarp荧光显微镜技术可以选择性观察儿茶酚胺以及5-羟色胺能神经元。这些胺类通路的研究又很快使得神经递质研究突破了对整个脑组织匀浆的局限性。20世纪70年代开始神经递质受体的生化研究、神经多肽免疫组化和位点的放射自显影研究，更是进一步促进了神经生理学家、神经解剖学家、神经化学家和神经药理学家们的对话。而过去两个世纪以来，分子生物学技术手段的应用更加丰富了这一交流。故可以说神经科学是一门整合性最强的科学学科，在蜜蜂领域亦是如此。

蜜蜂(Apis)是一种具有复杂行为的社会性昆虫[2]。蜜蜂的中枢神经系统是其正常信息处理的物质基础，而神经递质与蜜蜂复杂的社会行为有着非常紧密的关系。蜜蜂的大脑仅有约950,000个神经元，约1 mm3大小[3]，但其脑部神经递质却被广泛研究。正是因为蜜蜂大脑远远小于其它物种的大脑，并且意大利蜜蜂作为已经被测序的模式生物，所以它成为很多杰出生物科学家研究神经生物学的理想材料，蜜蜂脑内神经递质是一类具有生物活性的物质，在调控神经元信号传递、神经回路和生理功能中发挥极其重要的作用，并能参与调节视觉、昼夜节律、采集运动、生长发育、学习记忆等神经活动[4,5]。

除酪胺和章鱼胺研究较多外，在蜜蜂中备受关注的单胺类神经递质主要为儿茶酚胺类和吲哚胺类两种，其中儿茶酚胺类主要有多巴胺(dopamine)、去甲肾上腺素(norepinephrine)、肾上腺素(epinephrine)、左旋多巴(levodopa)和3,4-二羟苯乙酸(3,4-Dihydroxyphenylacetic acid)；吲哚胺类主要有5-羟色胺(serotonin)、5-羟-3-吲哚乙酸(5-Hydroxyindoleacetic acid)。多巴胺的直接前体物质为左旋多巴，由酪氨酸(tyrosine)经酪氨酸羟化酶代谢合成，多巴胺在特定酶的作用下经不同的代谢途径可生成3,4-二羟苯乙酸和去甲肾上腺素两种产物，并最终代谢为高香草酸，应用伏安法或者高效液相电化学检测法易于检测。在不同行为或者发育阶段，蜜蜂脑部生物胺类神经递质的种类和含量有着极为不同的变化，表明生物胺神经递质与蜜蜂行为有着密切联系。本文对多巴胺能神经系统在蜜蜂中的研究情况进行综述，以期为研究调控蜜蜂行为的神经分子机制的学者提供借鉴，特别是对蜜蜂舞蹈行为（虽然舞蹈行为的发现早在100多年以前），但是在真正意义上对蜜蜂舞蹈行为在分子神经科学上的完全阐明以及蜜蜂之间如何有效沟通还有待进一步更深入的研究。

1 蜜蜂脑部

蜜蜂的脑由前脑、中脑和后脑3部分组成，前脑构成脑的主要部分，前脑顶端着生3只单眼，中央有1对蕈形体（蘑菇体，mushroom bodies），主要功能是接收触角叶(antennal lobes)和视叶(optic lobes)的神经投射，在求偶调节、嗅觉辨别和视觉学习等方面扮演重要角色；前脑两侧膨大的2个大型的视叶是视觉功能的神经中心，视叶两侧各着生着复眼。主要由嗅叶组成的中脑位于前脑的后方，由其发出的1对神经分布到触角，是触觉的神经中枢。后脑较之其它部分不发达，由之发出的神经通至上唇和前肠。蜜蜂的神经系统包含主干神经中枢、腹部的神经弦和食管下的神经中枢。工蜂脑中一半以上属于视叶，约有851,458个神经细胞[6]。

2 蜜蜂脑部多巴胺影响生命活动

多巴胺与亢奋和欢愉的信息传递有关，能调节高等动物大脑的情感认知、学习记忆、躯体运动等行为活动[7]。多巴胺作为蜜蜂脑内一种非常重要的单胺类神经递质，在蜜蜂复杂的社会行为方面受到了研究者的广泛关注。蜜蜂脑部生物胺类神经递质含量的改变可能直接影响其行为[8-11]，不同的行为活动也会使多巴胺的含量发生变化。研究表明，多巴胺的直接前体左旋多巴在脱羧酶的作用下，可以生成多巴胺，多巴胺合成后储存在囊泡中。受到刺激后的多巴胺能神经元释放多巴胺到突触间隙，并与后膜的受体结合。产生作用后很大部分的多巴胺被突触前膜重摄取，有一部分可被多巴胺囊泡摄取再次使用，一部分则被代谢分解，极少部分的多巴胺在突触间隙内被分解或者被突触后膜吸收。多巴胺的再摄取需要多巴胺转运体(dopamine transporter, DAT)的参与。

目前，在不同蜂种、不同行为状态蜜蜂体内神经递质含量及代谢物的研究均取得了一定进展。多巴胺现已被证实参与蜜蜂日常行为、运动、记忆、繁殖等活动[12,13]，在稳定蜂群的社会构成、蜂群失王条件下雌性个体生殖生理变化、哺育、采集、舞蹈语言、防御和劳动分工等方面具有重要意义。通过注射多巴胺受体(dopamine receptor)拮抗剂，观察蜜蜂的伸刺反应，研究蜜蜂的惩罚性学习，发现注射多巴胺受体拮抗剂的蜜蜂不会进行惩罚性学习。不同行为状态蜜蜂间比较发现采集蜂的多巴胺含量高于哺育蜂，老龄蜜蜂比年轻蜜蜂有更高的多巴胺含量[8,14]，表明多巴胺可能与劳动分工有关。多巴胺可能调控雌性蜜蜂繁殖的作用已经被证实，当工蜂被饲喂多巴胺或者多巴胺前体物质后，工蜂的卵巢会开始发育[10,15]。在无王群中，随着失王时间的延长，在一定时间范围内，工蜂脑部多巴胺含量升高，同时卵巢也随之发育。同时也发现蜂王信息素能降低蜜蜂的大脑多巴胺含量，多巴胺水平的测量显示，来自有王群的工蜂的多巴胺含量比来自无王群的工蜂的多巴胺含量低，但在不同的年龄之间没有显著差异[16]。这也证明了工蜂较低的多巴胺含量使蜂王能够控制工蜂的行为，使蜂王能够在蜂群中扮演自己的角色和巩固自己的地位。神经递质多巴胺和下游产物去甲肾上腺素含量与卵巢发育呈正相关，卵巢发育越完善，多巴胺和NE含量越高[17]。多巴胺不仅和雌性蜜蜂的生殖发育有关，发现在雄蜂性成熟过程中也发挥重要作用，伴随着雄性器官的发育，雄蜂脑部的多巴胺含量随之增加，在婚飞前达到峰值[18]，对雄蜂注射多巴胺后，雄蜂的交尾飞行活动会显著增加[19]。另外，处女王的多巴胺含量比那些低攻击性的已交尾蜂王要高，不仅说明多巴胺可能会促进处蜂王的战斗和侵略行为[20]，也表明多巴胺和交尾活动有关。

蜜蜂从幼虫到蛹的发育过程中，多种生物胺含量渐渐上升，在成年蜂中，脑部多巴胺含量随着日龄的增多而增加，在采集蜂中多巴胺含量则处于较高浓度，相同日龄的蜜蜂中劳动分工也不太一样。同日龄不同工作的采集蜂体内生物胺也有差异，蜜蜂采集归巢的跳舞蜂多巴胺含量总是高于伴随蜂，向蜜蜂腹部注射多巴胺受体拮抗剂后，蜜蜂活跃性下降，注射多巴胺受体激动剂后活跃性增加[21]，而且经多巴胺拮抗剂处理后，出巢寻找蜜粉源的侦察蜂减少[22]，表明多巴胺可能与蜜蜂采集行为有关，也可能和舞蹈语言有关。给蜂群饲喂多巴胺的前体物质左旋多巴后跳舞蜂数量增加[23]，表明多巴胺可能参与调节蜜蜂舞蹈行为的神经活动。不仅蜜蜂自身的发育和劳动分工影响多巴胺的含量，不同食物也影响多巴胺的含量，工蜂和蜂王多巴胺的差异也可能是由于蜂王长期食用蜂王浆引起的，给蜜蜂饲喂酪氨酸和蜂王浆后，4日龄和8日龄工蜂脑部的多巴胺和代谢物显著升高[24]，同时巢外活动被抑制，由于蜂王浆中含有酪氨酸物质，所以脑部多巴胺差异可以由食物来源引起，这可能也是蜂王脑部多巴胺含量高于工蜂的原因。对蜜蜂行为的分子分析揭示了许多关键分子的参与，这些观察结果表明，多巴胺是调节蜜蜂行为的关键神经递质。

3 蜜蜂脑部多巴胺受体

脊椎动物和无脊椎动物都有2种不同的多巴胺受体，广泛分布于多巴胺神经元的细胞膜、轴突、树突，当D1型受体被激活时，多巴胺受体会增加细胞内的cAMP水平，而D2型多巴胺受体则会导致cAMP水平的降低，多巴胺生理功能是通过受体介导完成的[25]，在蜜蜂中，分子克隆技术已被用于识别两种蜜蜂基因编码多巴胺受体的同源性。目前有3种不同的多巴胺受体已被成功克隆，每个受体都有一个独特的表达模式，并且每个受体在成年工蜂的脑部都有表达，其中AmDOP1和AmDOP2为D1型受体可以激活腺苷酸环化酶，使环腺苷酸增加，AmDOP3为D2型受体，则起相反作用。此外，AmDOP2不仅通过环腺苷酸通路起作用，还与蜜蜂OA受体AmOA1共同利用钙离子通道起作用[26]。

利用细胞培养的方法发现，蜕皮激素和保幼激素水平对Amdop1、Amdop2、Amdop3的转录水平有显著影响，在保幼激素处理的蜜蜂的蘑菇体中，多巴胺受体基因Amdop1的表达水平明显降低[27]。用RNA干扰技术阻断D1型受体基因AmDOP2的表达，发现蜜蜂行走时间减少，停止和梳毛时间增多，说明多巴胺通过特定受体发挥作用[28]，多巴胺受体可能直接或者间接影响完整信号通路的信息传递，从而调控运动行为。蜜蜂被注射多巴胺受体拮抗剂后，多巴胺作用过程被阻断，蜜蜂终止惩罚性学习行为，但蜜蜂的奖励性学习行为能力增强[29]。

在关于蜜蜂的大脑药理学研究中，广谱型受体拮抗剂主要有三氟噻吨(flupenthixol)、螺哌隆(spiperone)、SCH23390，这些药物可通过竞争结合位点的方式影响多巴胺与受体之间的神经通路。不同药物作用于不同类型的受体，放射配体3H-SCH23390和3H-spiperone分别识别D1和D2型受体，选择特异性阻断某一受体的拮抗剂可以研究不同的神经通路。将三氟噻吨注射到1日龄的处女王的腹部，观察到多巴胺信号封锁程度升高，可以降低处女王打斗和蜇刺反应，并降低战斗的获胜率[20]。对刚出房的蜜蜂到正常采集的不同日龄蜜蜂脑部进行实时荧光定量PCR，发现多巴胺受体基因Amdop1、Amdop2和Amdop3在整个大脑的表达与日龄变化相关。

4 蜜蜂脑部多巴胺转运体

多巴胺转运体存在于多巴胺能神经元末梢，这个蛋白位于多巴胺神经元突触前膜中，具有重获取多巴胺的生理效应，常常作为成瘾药物的作用靶点之一。当多巴胺能神经元末梢接受到刺激信号时，多巴胺由突触前膜的囊泡中被释放到突触间隙并作用于突触后膜的受体后，DAT就变得活跃并很快将多巴胺再摄取，所以DAT能调控突触间隙中多巴胺的有效浓度，使多巴胺对突触前和突触后受体进行时间依赖性的激动[30]。DAT基因敲除的小鼠不能重新获取多巴胺从而滞留在突触间隙，动物不再呈现活动亢奋，也使D1和D2受体mRNA下调，相反，多巴胺的释放量也会调节DAT的活性。在蜜蜂中，转运体基因Amdat表达水平可以反映多巴胺能神经元的活动，通过逆转录的实时定量聚合酶链反应来测定蜜蜂脑部的表达水平。发现工蜂从内勤蜂转变为以日龄为基础的采集行为，脑部的转录水平也会随着日龄的增长而增加，与同龄的内勤蜂相比，早熟的采集蜂的表达水平要高得多，这表明，这种表达方式与任务转移有关；在雄蜂中，随着日龄的增加，基因表达量也增加；对于蜂王，在交尾之后，Amdat的表达水平下降了，认为可能是多巴胺能神经元活动增强刺激蜂王交尾，并在交尾后复原[31]，也验证了多巴胺神经通路活动与蜜蜂的行为活动有关。

5 展望

探索脑的奥秘是自然界最诱人的科学问题之一。神经科学是研究动物和人类神经系统与脑的结构和功能的科学，是研究行为、心理活动乃至智能以及神经系统疾病如何产生的科学。神经科学由于其研究对象的复杂性，一开始就是高度跨学科的综合学科，它得到了神经生理学家、神经解剖学家、神经化学家、神经药理学家、心理学家、医学家乃至工程科学家们的重视和参与。

多巴胺神经元在工蜂、雄蜂和蜂王的整个发育过程中会发生改变，蜜蜂多巴胺神经通路的深入研究对我们更深入了解蜜蜂的行为生殖发育、生命节律、生活特性等方面都是十分有意义的。多巴胺转运体是特异性位于多巴胺神经元的蛋白，可以研究多巴胺转运体的转录和多巴胺转运蛋白的分布，更加深入探讨多巴胺能神经元的功能。目前，对蜜蜂多巴胺的研究还有很广阔的空间，随着科学技术的发展，研究和开发的深入，可以用组织透明化抗体标定技术研究多巴胺转运体和受体的分布，原位杂交对相关基因定位乃至多巴胺小分子定位定量，多巴胺受体和转运体微观的化学结构，多个层次的研究相结合，进一步探讨和研究蜜蜂行为与多巴胺之间的相互关系以及蜜蜂舞蹈行为的分子调控机制，最后对蜜蜂的大脑功能进行描述，以期最终阐明蜜蜂脑功能如何控制其行为的发生与发展。

对于揭示神经递质之间的互作关系以及神经递质与行为之间的关系，进而对大脑功能分区和基因功能定位，就变得异常重要。运用CRISPR-Cas 9技术对蜜蜂基因组的多巴胺神经通路的关键基因进行敲除，不仅可以在分子层面研究目标基因的功能与作用通路，还可以阐明目标基因与蜜蜂行为之间的调控机制，诸多奥秘还有待于更深入的研究和揭示。

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