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(1. 浙江工业大学 化学工程学院, 杭州 310014; 2. 浙江省农业科学院 农产品质量标准研究所, 杭州 310021)

我国是农药使用大国,我国的蜂产品中一直存在着严重的农药残留污染问题。毒死蜱、蝇毒磷等有机磷农药为常用的广谱性杀虫、杀螨剂[1-2],残留于蜜源植物可能被蜜蜂采集、携带而污染蜂蜜;唑螨酯等杀螨剂则被直接施用于蜂群以防治蜂螨[3],极可能在蜂蜜中残留。目前,国内外关于蜂蜜中农药残留的最常用测定方法为气相色谱-质谱法[4-6]和液相色谱-质谱法[7-9]。由于分析基质的复杂性以及对目标物痕量分析的要求,同位素内标在痕量残留检测分析方面迅速发展[10-12],以保证质谱分析结果的准确性和稳定性。但多数农药并未研制出其相对应的同位素内标。

本工作建立了超高效液相色谱-串联质谱法快速测定蜂蜜中的14种杀虫剂残留,并以毒死蜱-D10作为内标,对14种杀虫剂的内标适用性进行筛选。

1 试验部分

1．1 仪器与试剂

超高效液相色谱-串联三重四极杆线性离子肼6500QTRAP质谱仪;SupercleanTMLC-NH2SPE净化柱(500 mg/6 mL);0.2 μm GHP针式滤膜。

吡螨胺、噻螨酮、乙螨唑、蝇毒磷、哒螨灵、炔螨特、螺螨酯、唑螨酯标准溶液:质量浓度均为100 mg·L-1。

甲基毒死蜱、倍硫磷、伏杀硫磷、杀螟硫磷标准溶液:质量浓度均为1 000 mg·L-1。

甲基嘧啶磷标准溶液:100 mg·L-1。

毒死蜱标准物质纯度为99.9%;毒死蜱-D10为自制,纯度为99%。

标准储备溶液:将标准溶液或标准物质分别用甲醇稀释配制成10.0 mg·L-1,放置于冰箱4 ℃冷藏避光保存。

混合标准溶液:移取一定量的10.0 mg·L-1标准储备溶液,用甲醇稀释配制成1.0 mg·L-1的含有14种杀虫剂的混合工作溶液,放置于冰箱内4 ℃冷藏避光保存。

毒死蜱-D10内标溶液:称取一定量自制的毒死蜱-D10,用甲醇溶解并稀释配制成1.0 mg·L-1,放置于冰箱内4 ℃冷藏保存。

甲醇、乙腈为色谱纯,甲苯、氯化钠、无水硫酸钠为分析纯,试验用水为一级水。

1．2 仪器工作条件

1) 色谱条件 ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm),柱温40 ℃;流量0.2 mL·min-1;进样量5 μL;流动相A为含0.1%(体积分数,下同)甲酸的2 mmol·L-1甲酸铵溶液,B为甲醇。梯度洗脱程序:0～3 min时,B由40%升至90%,3～8 min时,B为90%;8～8.5 min时,B由90%降至40%;8.5～15 min时,B为40%。

2) 质谱条件 电喷雾正离子源(ESI+);离子源温度为500 ℃;喷雾电压5 500 V;气帘气压力275.8 kPa;辅助气压力344.8 kPa;碰撞气为氮气;多反应监测(MRM)模式扫描,监测离子对和其他质谱参数见表1(*为定量离子对)。

表1 质谱参数Tab. 1 MS parameters

1．3 试验方法

称取蜂蜜样品2.000 0 g于50 mL离心管中,用水10 mL充分溶解。加入毒死蜱-D10内标溶液100 μL,涡旋混合15 s,加入氯化钠4 g,乙腈15 mL,涡旋混匀1 min后,以7 000 r·min-1转速离心3 min,取上层有机相,水相再加入乙腈15 mL重复提取一次,合并两次提取液,加入无水硫酸钠4 g,涡旋离心,取上层有机相,用旋转蒸发仪在40 ℃水浴下减压浓缩至近干,待净化。

氨基净化柱用乙腈-甲苯(3+1)混合液4 mL活化,用乙腈-甲苯(3+1)混合液2 mL洗涤样液瓶,重复3次,合并洗涤液,上净化柱,边过柱边接收,用乙腈-甲苯(3+1)混合液25 mL洗脱,合并于鸡心瓶中,用旋转蒸发仪在40 ℃水浴下减压浓缩至近干,氮吹至干,用甲醇定容至1 mL,过0.2 μm滤膜,在仪器工作条件下进行测定。

2 结果与讨论

2．1 毒死蜱-D10的定性分析

毒死蜱-D10的氘代位置见图1。

图1 毒死蜱-D10的结构式Fig. 1 Structure formula of chlorpyrifos-D10

分别对1.0 mg·L-1的毒死蜱-D10内标溶液和毒死蜱标准溶液进行母离子全扫描,质谱图见图2。

(a) 毒死蜱标准溶液

(b) 毒死蜱-D10内标溶液图2 母离子扫描质谱图Fig. 2 Mass spectra of Q1 scan

由图2可知:由于毒死蜱结构中存在3个氯,Q1母离子扫描模式下存在m/z350,352,354,356,而毒死蜱-D10则存在m/z360,362,364,366,与毒死蜱相差的质量数和氘代数目相对应。

对毒死蜱-D10内标溶液和毒死蜱标准溶液进行子离子全扫描,质谱图见图3。

(a) 毒死蜱标准溶液

(b) 毒死蜱-D10内标溶液图3 子离子扫描质谱图Fig. 3 Mass spectra of product ion scan

由图3可知:毒死蜱得到的子离子有m/z97,125,153,198,294,毒死蜱-D10得到相对应的子离子m/z99,131,163,199,296。

2．2 毒死蜱-D10离子对的选择

对毒死蜱和毒死蜱-D10所得离子对的去簇电压、碰撞能量进行优化,优化后的质谱参数见表2。

表2 毒死蜱和毒死蜱-D10的质谱参数Tab. 2 MS parameters of chlorpyrifos and chlorpyrifos-D10

在蜂蜜样品中添加50 μg·kg-1的毒死蜱和毒死蜱-D10,得各不同离子对的响应色谱图。结果发现,毒死蜱和毒死蜱-D10各离子对中响应最好的分别为350/198,350/97和360/199,360/99,在蜂蜜基质中受基质效应影响相对较小。因此,试验选择350/198*,97和360/199*,99作为毒死蜱和毒死蜱-D10的定性、定量离子对。

2．3 试验条件的选择

2．3．1 色谱条件

试验在流动相中加入一定量的甲酸提高离子化效率,改善峰形和分辨率;加入甲酸铵缓冲溶液,使得离子抑制效应得到补偿,得到更好的响应;采用较缓的梯度洗脱使各目标化合物得到一定的分离。结果表明:用甲醇-2 mmol·L-1甲酸铵溶液(含0.1%甲酸)作流动相,在梯度洗脱条件下,14种杀虫剂的UPLC-MS/MS分析色谱峰分离度良好,峰形好且响应高。加标浓度为50 μg·kg-1的空白蜂蜜样品中14种杀虫剂及毒死蜱-D10的色谱图见图4。

1-杀螟硫磷;2-蝇毒磷;3-倍硫磷;4-伏杀硫磷;5-甲基嘧啶磷;6-甲基毒死蜱;7-吡螨胺;8-噻螨酮; 9-毒死蜱;10-炔螨特;11-乙螨唑;12-唑螨酯;13-螺螨酯;14-哒螨灵;15-毒死蜱-D10图4 空白蜂蜜样品加标50 μg·kg-1的选择离子色谱图Fig. 4 Select ion chromatograms of the blank honey sample spiked with 50 μg·kg-1 standards

2．3．2 提取剂及其用量

试验比较了乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷-丙酮混合液的提取效率。二氯甲烷-丙酮混合液作为提取剂时易发生乳化,提取过程操作不便,提取效果不佳;乙酸乙酯与水不互溶,对于微溶于水的化合物提取效果不及乙腈。综合考虑,试验选择乙腈作为提取溶剂。

试验比较了不同体积(5,10,15,20,25 mL)的乙腈的提取效果,结果表明:当乙腈用量达到15 mL时,已可得到较高的回收率;继续增加提取剂的用量,回收率提高不明显。因此,试验选择提取溶剂的体积为15 mL。

2．3．3 洗脱剂用量

试验比较了不同体积(10,20,25,30,35 mL)洗脱剂的洗脱效果,结果表明:洗脱剂体积为25 mL时,可将目标化合物很好的洗脱,达到较高的回收率;继续增加洗脱剂的用量,回收率提高不明显。因此,试验选择洗脱剂的体积为25 mL。

2．4 基质效应

根据1.3节的提取净化步骤配制100,50,10 μg·kg-1等3个加标水平的蜂蜜基质匹配溶液,用甲醇配制对应添加浓度的杀虫剂混合标准溶液,以基质匹配标准溶液和标准溶液的目标物峰面积比值评价基质效应,比值越接近1.0,说明基质效应越弱。14种杀虫剂的基质效应见图5。

由图5可知:14种杀虫剂在蜂蜜基质中均呈现离子抑制状态,其中伏杀硫磷、甲基嘧啶磷、甲基毒死蜱、吡螨胺、噻螨酮、毒死蜱的基质效应均小于0.6,杀螟硫磷、蝇毒磷、倍硫磷、炔螨特、螺螨酯的基质效应接近0.6,乙螨唑、唑螨酯、哒螨灵的基质抑制作用相对较小。

2．5 内标法与基质匹配法的比较

由2.4节可见,14种杀虫剂在蜂蜜基质中均存在一定的基质抑制作用,可使用内标或通过基质匹配法消除基质效应对定量结果的影响。对前处理步骤进行破坏试验,比较内标法与基质匹配法。

2．5．1 内标法对提取步骤损失的校正作用

通过破坏试验,模拟提取过程提取溶液的损失,验证毒死蜱-D10同位素内标对提取过程的校正作用。在空白样品中添加50 μg·kg-1的14种杀虫剂的混合标准溶液,根据1.3节的样品提取方法进行提取,分别取10,20,30 mL提取液根据1.3节的净化方法进行净化后定容进样,不同体积提取液各平行分析3次,根据基质匹配法和内标法计算得到的回收率见图6。

图5 100,50,10 μg·kg-1等3个加标水平下14种杀虫剂的基质效应Fig. 5 Matrix effects for the 14 insecticides at the spike levels of 100, 50, 10 μg·kg-1

图6 10,20,30 mL提取液下的回收率Fig. 6 Recovery at the extracting solution of 10, 20, 30 mL

由图6可知:当提取液产生损失时,以基质匹配法计算得到的回收率波动极大,前处理损失较大时,其回收率均小于60%,不符合残留检测的要求;而加入毒死蜱-D10同位素内标以内标法计算时,得到的回收率稳定,符合残留检测的要求。因此,当提取液发生损失时,内标法对其引入的误差校正效果明显。

2．5．2 内标法对定容步骤不准确的校正作用

通过破坏试验,模拟定容步骤的操作失误,验证毒死蜱-D10同位素内标对定容过程的校正作用。在空白样品中添加50 μg·kg-1的14种杀虫剂的混合标准溶液,按照1.3节的步骤进行提取和净化,过柱后的洗脱液在氮吹至干后,分别用甲醇定容至1.5,1.0,0.5 mL后进样,不同定容体积分别做3个平行试验,根据基质匹配法和内标法计算得到的回收率见图7。

图7 1.5,1.0,0.5 mL定容体积下的回收率Fig. 7 Recovery at the constant volume of 1.5, 1.0, 0.5 mL

由图7可知:当定容不准确时,以基质匹配法计算得到的回收率波动极大,定容溶剂添加不当将引入极大的误差,使得检测结果不符合残留检测的要求;而加入毒死蜱-D10同位素内标以内标法计算时,得到的回收率稳定,符合残留检测的要求。因此,当定容不准确时,内标法对其引入的误差校正效果明显。

由上述破坏试验的结果可知,内标法除了对基质效应有良好的消除作用之外,还可以对前处理步骤产生的误差进行校正。此外,内标法相较于基质匹配法操作更为简便,还可以校正仪器波动带来的误差,因此化合物适用性符合时优先选择内标法进行定量。

2．6 内标的适用性

在蜂蜜基质中进行100,50,10 μg·kg-1等3个水平的加标回收试验,每个水平做6个平行,通过内标法计算其回收率,结果见图8。

由图8可知:毒死蜱经内标校正后的回收率在87.5%～91.3%之间,相对标准偏差(RSD)在3.3%～5.4%之间,同位素内标对基质效应的校正效果明显。噻螨酮、伏杀硫磷、甲基毒死蜱、甲基嘧啶磷的基质效应与毒死蜱相近,校正后的回收率在84.3%～110%之间,RSD在2.7%～6.9%之间;炔螨特、蝇毒磷、倍硫磷的基质效应相较于毒死蜱稍小,经内标校正后回收率在110%～129%之间,RSD在1.7%～6.0%之间。上述化合物经内标法计算得到的回收率和RSD均符合残留检测的要求,可采用毒死蜱-D10同位素内标进行定量,而吡螨胺、哒螨灵、螺螨酯、乙螨唑、唑螨酯、杀螟硫磷则需采用基质匹配法来校正其基质效应。

图8 100,50,10 μg·kg-1等3个加标水平下14种杀虫剂的回收率Fig. 8 Recovery of the 14 insecticides at the spike levels of 100, 50, 10 μg·kg-1

2．7 标准曲线与检出限

由2.6节可得,毒死蜱、甲基毒死蜱、甲基嘧啶磷、伏杀硫磷、倍硫磷、蝇毒磷、噻螨酮、炔螨特可采用毒死蜱-D10作为同位素内标进行定量,而吡螨胺、杀螟硫磷、唑螨酯、螺螨酯、乙螨唑、哒螨灵则采用基质匹配法进行定量;14种杀虫剂的质量浓度在1.0～200 μg·L-1内呈线性,线性回归方程及相关系数见表3。

分别以3倍信噪比、10倍信噪比计算检出限(LOD)及测定下限(LOQ),结果见表3。

表3 线性回归方程、相关系数、检出限及测定下限Tab. 3 Linear regression equations, correlation coefficients, LODs and LOQs

2．8 精密度与回收试验

对空白蜂蜜样品进行加标回收试验,测定14种杀虫剂在10,50,100 μg·kg-1等3个加标水平下的回收率,每个水平做6个平行,结果见表4。

由表4可知:回收率为81.9%～129%,RSD不大于11%,准确度与精密度均满足蜂蜜中多种杀虫剂的残留测定要求。

2．9 样品分析

应用本方法对40个市售蜂蜜样品进行分析,检测结果见表5,其中“-”表示未检出。

表5 40个实际样品的分析结果Tab. 5 Analysis results of 40 real samples

由表5可知:对于已制定最大残留限量的蝇毒磷和唑螨酯两个目标分析物,最大检出量均小于规定的最大残留限量;对于其他目前还未制定蜂蜜中最大残留限量的杀虫剂,最大检出量为11.0 μg·kg-1。可见蜂蜜中杀虫剂的残留量较小,提高定量的准确性十分重要,同位素内标的使用是必要的。

本工作建立了超高效液相色谱-串联质谱法测定蜂蜜中的14种杀虫剂残留的方法。方法以自制毒死蜱-D10作为内标,对14种杀虫剂的内标适用性进行了筛选,经验证,毒死蜱、甲基毒死蜱、甲基嘧啶磷、伏杀硫磷、倍硫磷、蝇毒磷、噻螨酮、炔螨特可采用毒死蜱-D10作为内标进行定量。使用同位素内标可有效消除基质效应的影响和样品前处理步骤所产生的回收率误差,避免其对检测结果造成偏差,提高方法定量的准确性。

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