郑智唯，赵 云，刘朝奇

(三峡大学医学院，湖北 宜昌 443002)

近年，超声靶向破坏微泡(ultrasound targeted microbubble destruction， UTMD)介导的基因递送具有安全性高、重复性好和组织靶向高的优点，在糖尿病治疗中已经取得很大进步，并有望用于临床。本文就UTMD技术及其在糖尿病基因治疗中的研究进展进行综述。

1 糖尿病的基因治疗

糖尿病是因胰岛素分泌缺陷、生物作用受损，或二者协同引起，并以高血糖为特征的代谢性疾病，现已经成为继心脑血管疾病、癌症后威胁人类生命的第三大非传染性疾病。国际糖尿病联盟( International Diabetes Federation, IDF )2011年调查结果显示，全世界糖尿病患者己达3.66亿，预计2030年将上升至5.52亿[1]。现阶段对糖尿病的研究已取得了一系列进展。目前认为注射胰岛素是治疗糖尿病的有效方法[2]。然而，注射外源性胰岛素及其类似物存在需多次注射、胰岛素无法自身按生理需求分泌及需密切监控等问题，故基因治疗受到逐渐关注。

针对因胰岛素缺乏导致的1型糖尿病的主要基因治疗策略如下：①直接导入胰岛素的替代基因，其首要原则是利用胰岛素原的cDNA替代缺乏的胰岛β细胞；由于以腺病毒为载体，其免疫原性缩短了基因的表达时间[3]，故其临床应用有限。②刺激β细胞再生。移植胰岛是治疗1型糖尿病的有效方法，但胰岛源稀缺及人体对异体器官的免疫排斥反应一直是器官移植的难题。研究[4]发现，胰十二指肠同源异型盒基因1(PDX-1)蛋白是胰岛素基因转录的重要调节因子，在β细胞特异性启动子的控制下，PDX-1过度表达有助于刺激胰岛细胞增殖。Xu等[5]发现补充L-精氨酸可以通过激活蛋白激酶B(AKT)和PDX-1来改善糖尿病大鼠后代的胰岛素敏感性和β细胞功能。Samson等[6]利用PDX-1促使内分泌细胞转变为胰岛细胞的能力来取代胰岛移植治疗1型糖尿病。③改善胰岛β细胞免疫应答，可治疗因免疫耐受缺失引起的胰岛β细胞受损导致的1型糖尿病。理论上基因疫苗可从根源上预防糖尿病的发生、发展，但其所引起的免疫应答在某些情况下可致病，即可能发生严重过敏反应[7]。④提高胰岛β细胞对血糖浓度的敏感性，可治疗胰岛素抵抗导致的2型糖尿病。胰高血糖素样肽1(GLP-1)是胰高血糖素原基因翻译后加工修饰的L细胞分泌的一种肠降血糖素，能诱导胰岛β细胞增殖和分化，促进葡萄糖依赖的胰岛素分泌，抑制胰高血糖素分泌，降低血糖水平[8]。研究[9]发现，胰腺α细胞衍生的胰高血糖素相关肽为β细胞适应和葡萄糖稳态所必需。现阶段GLP-1基因治疗主要是以腺病毒为载体的基因递送及电穿孔法，受限于其免疫原性和有创性及短半衰期，用于临床治疗依然存在困难。

糖尿病导致的一系列并发症，如糖尿病性视网膜病变[10]、糖尿病心脏病、糖尿病肾病等的基因治疗也受到广泛关注。研究[11]显示，通过局部维持肾素、血管紧张素系统之间的平衡，可以预防和逆转糖尿病性视网膜病变和其他糖尿病性微血管并发症，为治疗和预防糖尿病提供了新的思路。寻找特异的作用靶点，有效的治疗基因，合理的投递系统是目前基因治疗面临的首要任务。

2 UTMD技术的应用研究

超声微泡造影剂的出现与发展开辟了超声无创诊断和治疗的新领域。超声微泡是一种生物可降解外壳包裹不同气体形成的球状物质，根据外壳材料的不同和包裹气体的差异，前后经历了4代的更新和发展，其稳定性不断增加，粒径不断降低，生物相容性越来越好。随着研究的深入，超声微泡造影剂不仅是一种超声显像对比剂运用于临床诊断，而且可作为药物、基因的载体用于疾病治疗。

近年来，靶向超声微泡以其精确的靶向性、高效的治疗作用、良好的临床应用前景[12]而成为现阶段研究的热门。UTMD是指携带药物或基因的超声微泡造影剂到达特定组织时，利用低频率和高机械指数的间歇性超声击破微泡，将微泡携带的药物或目的基因释放出来，达到对病变部位进行靶向治疗的目的[13-14]。研究[15]表明，UTMD介导基因传输主要与其产生的空化效应有关。微泡在超声波作用下产生振动，使细胞膜通透性增加，甚至产生可逆性小孔，促进细胞对基因或其他大分子物质的摄取，为靶向基因治疗提供了基础。与病毒载体相比，超声微泡具备的低免疫原性、可重复性和靶向性的特点，且UTMD可保护基因片段不被核酸酶降解和网状内皮系统清除，能在增加药物、基因传输，提高局部摄取的同时降低机体摄入总量，减轻全身毒副作用。

UTMD介导的基因治疗是超声医学发展最快的领域之一，在心血管、肿瘤等研究领域已经取得一些成果。Zhang等[16]利用UTMD联合阳离子脂质(CMBs)微泡将shPHD2基因转染大鼠心肌细胞(H9C2)和缺血性心肌组织，发现UTMD联合CMBs可提高质粒DNA转染效率，通过UTMD转染shPHD2可有效下调PHD2基因，激活参与低氧反应途径的下游血管生成基因的表达，增强新血管生成，减少心肌细胞凋亡，从而改善大鼠心肌梗死模型的心室功能。UTMD介导的基因治疗在宫颈癌、肝癌、前列腺癌等治疗方面均获显著效果；联合聚焦超声，通过开放血脑屏障，在治疗脑肿瘤方面也取得了显著成果[17]。UTMD可通过诱导血管内皮细胞凋亡增加肿瘤对放射线的敏感度，从而增强放射治疗的疗效，是肝细胞癌放疗的有效辅助手段[18]。关于超声辐照最佳条件的研究也取得了一些成果。Ling等[19]研究显示，与0.5 W/cm2或对照组相比，1.5 W/cm2和1 W/cm2组的基质细胞衍生因子1和血管内皮生长因子表达显著升高(P<0.01)；与1.0 W/cm2组相比，1.5 W/cm2组的白细胞介素1β表达增加了2倍，而0.5 W/cm2组则无明显变化。Li等[20]认为在目的基因达到最高表达的同时，须注意超声强度对机体有无影响，以便确定最佳条件超声辐照条件，使UTMD真正成为一种高效安全的基因治疗手段。

3 UTMD在糖尿病的基因治疗中的应用

Xing等[21]通过UTMD治疗胰腺肿瘤，即将载有目的基因的超声微泡造影剂通过血液循环到达胰腺组织，在一定强度超声照射下破裂，将基因定向递送到靶组织。Chen等[22]利用UTMD将RIP-人胰岛素和RIP-己糖激酶I质粒递送至成年大鼠的胰岛，前者使人C肽明显增加、血糖水平降低，后者使胰岛己糖激酶Ⅰ蛋白表达明显增加、血液中胰岛素含量增加、葡萄糖水平降低，提示UTMD可无创地将基因递送至胰岛，调节β细胞功能。Chen等[23]对链脲霉素诱导的糖尿病模型狒狒进行研究，运用超声靶向微泡破坏技术递送cyclinD2、CDK4和GLP-1基因的复合物，成功诱导了胰岛再生和β细胞质量的恢复。人血管素样蛋白8(ANGPTL8)可促进胰腺β增殖并干扰小鼠三酰甘油代谢，但其引起的严重高甘油三酯血症限制了其临床应用。近年研究[24]表明，UTMD 介导的ANGPTL8基因递送可促进成年和老龄β细胞增殖，扩大β细胞团，改善葡萄糖耐量。UTMD治疗后空腹血胰岛素水平升高，但未引起严重的高甘油三酯血症，提示故UTMD可优化现有治疗方法，具有临床治疗意义。

田新桥等[25]通过对大鼠腹腔注射1%链脲佐菌素溶液，成功构建了糖尿病心肌病大鼠模型，并运用超声破坏经尾静脉注射的携aFGF微泡造影剂进行干预治疗，结果显示超声微泡靶向递送aFGF可以增加心肌微血管数量，降低心肌胶原含量，具有抗心肌细胞凋亡作用，有效改善大鼠左心室舒缩功能。Wu等[26]实验证实UTMD可提高肾组织通透性，并且具有可恢复性。超声破坏载SDF-1微泡靶向释放SDF-1可以提高肾脏SDF-1浓度水平，促进移植的外源性间充质干细胞肾向归巢能力，有效延缓糖尿病肾病的进展。虽然UTMD介导的基因表达为一过性，但基因表达结束所产生的生物学效应却持久存在，为基因治疗人类糖尿病奠定了基础。

4 问题与展望

超声微泡介导的基因递送在糖尿病的基因治疗中展现出了巨大潜力，较病毒载体安全、高效，在动物实验中取得了一系列研究成果，但在用于临床治疗之前，还存在一系列难题亟待解决：①寻找新的有效治疗基因，不仅要研究单个靶基因，且要根据糖尿病形成调控基因异常表达的相关信号通路，发现更多有效的基因。②寻找保证超声微泡载体质量和提高转染效率策略。UTMD介导的以超声微泡为载体的基因转染效率仅40%左右，故优化超声微泡造影剂制备工艺，在降低粒径的同时提高稳定性，制备出高质量的超声微泡以及探索合适的超声辐照条件，对于提高转染效率具有重要意义。③UTMD介导的基因治疗安全性和伦理性仍有待观察。为降低微泡造影剂和基因用量，减少不良反应，避免资源浪费，应进一步深入研究结合特异性配体的靶向超声微泡造影剂。

总之，基因治疗为治疗糖尿病及其并发症提供了新的思路，UTMD又为基因治疗提供了有效的方法，相信UTMD介导的糖尿病基因治疗将会成为有效的临床方法。

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