胡劼，焦明克，刘立洁，张鹏，牛盈盈

1.新疆医科大学第四附属医院心脏超声科，新疆乌鲁木齐 830000；2.重庆市渝北区人民医院超声科，重庆 400000；3.新疆军区总医院医学工程科，新疆乌鲁木齐 830000

前言

作为一种新兴药物载体，携载药物的靶向超声微泡相对其他载体具有不具免疫性、可实现靶向爆破、稳定、减少药物副作用等优势，能够实现在超声波辅助下进行药物靶向无创治疗［1-2］。血管新生类疾病，如癌症、动脉斑块等对机体造成病理侵蚀的疾病，是损害健康的无形杀手［3-4］，采用抑制血管形成因子、打破血管形成等血管新生阻断疗法是治疗血管新生类疾病的研究热点［5-6］。色素上皮源因子（Pigm Entepithelium-Derived Factor,PEDF）被证实在所有抗新生血管因子中作用最强，且能在体内拮抗多种血管新生因子, 并完全抑制它们活性的发挥［7-8］，但PEDF无法直接有效地作用于病灶［9］。为实现新生血管抑制因子PEDF 在有效直达病灶治疗血管新生类疾病的同时，降低其不良反应，本实验首次将多聚体超声微泡与PEDF 相结合，制备最大药物结合率的靶向超声微泡，并进一步研究该超声微泡的理化特性，以期为新生血管类疾病的治疗提供合适的药物载体，为形成靶向、无创、有效的新治疗方法奠定基础。

1 材料和方法

1.1 主要材料及设备

本实验主要材料包括表面活性剂Span 60、Tween 80、PBS、PEG、HPC、六氟化硫气体（SF6）、PED抗体（C1224MSDS,Sigma-Aldrich,USA）、氯仿、胆固醇和（NH4）2SO4缓冲液。设备包括高强度超声处理器（VCX-750, Sonix, USA）、分光光度计（AquaMate 8000, Thermo-Fisher, USA）、库尔特粒度仪（Multisizer III, Bechman-Coulter, USA）、流式细胞仪及荧光显微镜等。

1.2 多聚体微泡的制备及保存

将Span 60 和Tween 80 混合表面活性剂与不同聚合度的PEG 溶于PBS 中，在磁力搅拌器上加热至60 ℃，待完全溶解后，将所得溶液置于高压蒸气内进行消毒，进而再置于磁力搅拌器上持续搅拌，冷却至室温。设定高强度超声处理器功率为400 W，采用声振法处理上述冷却后的非离子表面活性剂溶液1 min，同时在溶液上方通入SF6，最终得到乳白色微泡悬浮液。用50 mL的PBS稀释10 mL的原始微泡，将微泡稀释液移入分液漏斗中静置20 min，然后采用上浮法对微泡稀释液进行分级分离。在零下4 ℃及室温下的不同时间段对微泡进行观察，并将制得的微泡在4 ℃下分装于不同玻璃小瓶进行恒温保存。

1.3 包裹不同浓度PEDF脂质体的制备

以3：1的质量比将胆固醇与HSPC（氢化卵磷脂）混合溶于氯仿中，制得20 mg/mL 浓度的混合液。氯仿在容器底部形成一层脂质膜，通过旋转蒸发去除；然后用300 mmol/L 的（NH4）2SO4缓冲液进行水合得到脂质乳状液，进而依次用800、400、200 和100 nm的挤出膜对乳状液进行挤出；最后将脂质体通过葡聚糖凝胶柱层析，得到跨膜铵梯度脂质体。将浓度分别为0.4、2.0、10.0 和50.0 μg/mL 的PEDF 与跨膜铵梯度脂质体以8：5 的体积比进行混合，在65 ℃进行孵育25 min，冰浴45 min。

1.4 多聚体超声微泡-药物复合体的制备及最大结合率检测

分别将荧光和生物素标记的包裹不同浓度PEDF 的脂质体与制备好的微泡进行混合，因微泡表面活性物质中含有具有一定粘附作用的PEG，因此可以将脂质体黏附在其表面，从而形成多聚体超声微泡-药物复合体。采用Multisizer III 对复合体的粒径进行测量，测量使用30 μm 的小孔管和300 通道。通过Photoshop 图像分析软件对复合体浓度进行测定。应用荧光显微镜及流式细胞仪检测测定药物的有效加载情况，并确定药物与微泡的结合率。

1.5 脂质体对PEDF的包封率测定

针对测得具有最大超声微泡结合率的PEDF 脂质体，取其混合液200 μL 直接进行破乳，采用AquaMate 8000 分光光度计进行吸光度检测，测得吸光度为A0；同时再取200 μL上述混合液上样置于G-50离心柱上，离心洗脱得到包裹有PEDF 的脂质体，收集洗脱液破乳，测得吸光度为A1；最后通过式（1）得到脂质体对药物PEDF的包封率。

1.6 PEDF多聚体超声微泡体外释药特性

精密称取50 mg 载药多聚体微泡悬浮于10 mL 0.1 mol/L的PBS 中，并将该溶液置于透析袋内密封，在保持37 ℃的情况下，应用超声体外击破微泡，在预定时间间隔15、30、45、60、75、90、105 s及5、7、10 min，取出1 mL 溶液，通过分光光度法测定PEDF 的含量，同时补加等量的PBS。

1.7 统计学分析

采用SPSS 16.0 软件进行统计学分析，计量数据采用均数±标准差表示，两组均数间比较采用t检验，多组均数间比较采用单因素方差分析和SNK-Q 检验，以P<0.05作为显著性检验标准。

2 结果

2.1 多聚体超声微泡-药物复合体的粒径

应用Multisizer III 和Photoshop 图像分析软件得到该新型多聚体微泡的平均直径为（3.17±0.13）μm，浓度为（3.00±0.11）×109/mL。

2.2 不同浓度PEDF在多聚体超声微泡上的加载及结合率

在荧光显微镜下观察各组不同浓度PEDF 与微泡结合情况，初步明确结合率与药物浓度的相关性。由图1可观察到0.4 μg/mL 浓度实验组PEDF 与超声微泡未见明显结合，2.0 μg/mL 浓度实验组可观察到少量PEDF 与微泡结合，10.0 μg/mL 浓度实验组可见中量PEDF 与微泡结合，50.0 μg/mL 实验组可见大量密集PEDF与微泡结合。因此可基本判断PEDF与超声微泡的结合率随PEDF浓度的增加而逐渐增大。

图1 荧光显微镜观察不同浓度PEDF与超声微泡结合情况Fig.1 The binding of different concentrations of PEDF to ultrasound microbubbles was observed by fluorescence microscope

进而，为定量描述PEDF 与超声微泡的结合特性，本研究采用流式细胞仪检测多聚体超声微泡-药物复合体的载药量结合率。流式细胞仪检测结果的分布统计以单参数直方图的方式自动显示（图2）。0.4 μg/mL 浓度实验组PEDF 与微泡的结合率为0%，2.0 μg/mL 浓度实验组PEDF 与微泡的结合率为（10.58±0.61）%，10.0 μg/mL浓度实验组PEDF与微泡的结合率为（54.94±0.83）%，50.0 μg/mL 浓度实验组PEDF 与微泡的结合率达到（96.14±1.21）%。随着PEDF 浓度的继续升高，药物将不再与超声微泡相结合，药物浓度已达到饱和状态。

图2 不同浓度PEDF与微泡结合情况单参数直方图Fig.2 Single parameter histogram of different concentrations of PEDF binding to ultrasound microbubbles

2.3 脂质体对PEDF的包封率及体外释药特性

根据吸光度A0与A1以及包封率计算公式，测得PEDF 多聚体超声微泡的包封率为（79.20±2.31）%。表明该PEDF 超声微泡具有良好的载药包封特性，可以作为载药系统运载PEDF。超声作用下，在预定时间间隔15、30、45、60、75、90、105 s 及5、7、10 min，对取出的等份PEDF 多聚体微泡悬浮溶液，通过分光光度法测定PEDF 的含量，绘制其体外释药特性曲线（图3）。从图中可以看到从微泡被超声击破后第15 s开始观察到PEDF 释放，在45～60 s 药物浓度达到峰值（65±3）%，而在剩余的时间内，药物浓度略有升高，持续观察10 min 后浓度开始显著降低，该结果说明PEDF超声微泡在短时间内具有连续释药特性。

图3 PEDF多聚体超声微泡药物释放率Fig.3 In vitro drug release rate of PEDF-loaded polymer ultrasound microbubbles

3 讨论

针对癌症、颈部动脉斑块等血管新生类疾病，研究表明直接在病变部位注射可以使药物表达效率提高，但该方法具有有创性，应用受到一定的局限［10-11］。病毒载体是公认的高效转染的载体，但有免疫原性和潜在药物突变的危险［12-13］。本实验首次将PEDF对新生血管因子的有效抑制作用与多聚体超声微泡载药靶向治疗的特性相结合，研制性能优异的PEDF 多聚体超声微泡，利用微泡在超声介导下的空化效应，靶向传输药物，达到安全有效治疗的目的［14-15］。

多聚体超声微泡与其他载体相比，其构成成分多为脂类、糖类以及可生物降解的多聚体，不具有免疫原性，体积小且较稳定，在不经受一定强度的超声声能照射的情况下可以在体内保持稳定，仅在超声照射区域内，即观测的病变部位破裂，从而可实现靶向释药，同时，超声介导微泡破坏还可促进其携带药物通过血管内膜屏障，释放到靶向组织和器官的血管外间质，增加靶细胞的药物浓度［16-17］。本实验研制的多聚体微泡为人工合成医用多聚体高分子材料，其生物相容性好，在体内能自然降解成水和二氧化碳，对人体无任何毒副作用，免疫原性低，可通过肾脏排出体外，在体内不会有积累。

PEDF是重要的新生血管抑制因子［18］，本实验针对多项疾病由于新生血管形成影响疾病转归的问题，首次提出应用超声微泡作为载体，并结合新生血管抑制因子制备形成一个新型的药物复合体，且明确了PEDF与新型超声微泡载体的结合特性，并研制了具有最大药物结合率的超声微泡。对PEDF超声微泡包封率和释药特性的检测结果表明，PEDF超声微泡与其他已知性能优异的载药微泡具有相似的理化特性，如HCPT超声微泡、舒尼替尼超声微泡等［19-20］。本研究虽然为实现采用多聚体微泡携带药物靶向治疗血管新生类疾病的研究奠定了基础，然而现仍处于基础阶段，多聚体微泡到达病灶部位在超声辅助下释放药物的疗效、作用机理以及相应的其他不可预知作用尚需进一步的研究验证。