孙琦 俞一峰

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2010年8月～2012年6月在江阴市人民医院行手术治疔的结直肠癌患者, 年龄25～85岁, 平均年龄(61.5±10.1)岁。随访采用门诊复查、电话、书信、电子邮件等方式进行。无病生存期定义根治性治疗后到肿瘤复发或因各种原因出现死亡的时间, 以月为单位计算。至研究终点(2017年5月)。其中具有完整随访资料者138例, 随访时间(43.9±21.6)个月。

1.2 MSI检测

1.2.1 核酸提取 血液标本：采用新景血液提取试剂盒；DNA无需稀释, 直接用于聚合酶链反应(PCR)。石蜡标本：采用QIAGEN石蜡提取试剂盒；DNA稀释至20 ng/μl用于PCR的模板。核酸定量：使用Qubit进行核酸定量。

1.2.2 试剂 引物为NR-21、NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26, 产物长度分别为110 bp、132 bp、154 bp、123 bp、122 bp, 修饰方法分别为5'-FAM、5'-FAM、5'-HEX、5'-TMR、5'-HEX。

1.2.3 操作步骤 反应体系的配制：以一个位点的体系配制为例。从-20℃冰箱中取出试剂以及待检样品DNA, 待其融化后, 短暂离心, 将管壁和管盖上的液体收集到管底。在试剂准备区配制20 μl PCR反应体系, 各组分及添加量如下。

1.2.4 PCR扩增 在扩增区按如下的反应条件进行PCR扩增 ：94℃ 4 min, 94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s 10 个循环 ,94℃ 30 s、53℃ 30 s、72℃ 30 s 30 个循环 , 72℃ 30s, 10℃ ∞。

1.2.5 琼脂糖凝胶电泳鉴定结果 取3 μl PCR扩增产物混合2 μl loading buffer, 在1.5%琼脂糖凝胶上直接点样, 120 V电泳20 min, 于凝胶成像仪下观察结果。

1.2.6 混合各位点PCR产物送毛细管电泳分析 将血液和石蜡样本五个位点的PCR产物分别混合成一管约15 μl的混合物, 各位点PCR产物的添加量视电泳条带亮度而定, 若五个位点条带亮度一致, 则添加比例为1∶1∶1∶1∶1；若条带亮度有差异, 则根据实际情况适当调整添加比例, 条带较亮的可适当减少添加量, 反之, 条带较暗的则可适当增加添加量。将混合好的产物外送进行毛细管电泳分析, 送上海生工生物测序。

1.3 免疫组化检测四种MMR蛋白 10%中性磷酸缓冲福尔马林固定24～48 h, 常规脱水、固定、石蜡包埋, 免疫组化检测四种MMR蛋白。①MLH1, 兔单抗, 克隆号ES05, 即用型；②PMS2, 兔单抗, 克隆号EP51, 即用型；③MSH2, 兔单抗,克隆号FE11, 即用型；④MSH6, 兔单抗, 克隆号EP49, 即用型；上述一抗均为SANTA CRUZ公司。所用二抗是DAKO EnVision TM二步法抗兔、鼠通用型免疫组化试剂, 所用免疫组花仪是DAKO AutostainerLink 48。每张切片含有正常肠黏膜、肿瘤周围组织、炎性组织作为内对照。判断标准为内对照细胞核阳性而癌组织全阴性(即没有1个细胞核染色)时, 表面该蛋白表达缺失［1,2］。两名病理科主治以上医师阅片,如果有分歧, 请第三名高年资病理科医师裁决。

1.4 观察指标 比较138例患者基因检测同免疫组化检测结果, MSI-H肿瘤的影响因素, MSI与术后化疗的关系。

1.5 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差( x-±s)表示, 采用t检验；计数资料以率(%)表示, 采用χ2检验。用Kaplan-Meierk生存曲线进行生存率估计, 以Log-rank进行生存率的比较, P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基因检测同免疫组化结果 基因检测103例MSS, 4例为MSI-L, 而免疫组化检测发现MSI-H, 免疫组化显示4例中PMS2缺失2例, MSH2缺失1例, MSH6缺失1例。

2.2 MSI检测基本特征 31例(22.5%)为MSI-H, 36例(26.1%)为MSI-L, 71例(51.4%)为MSS。通过MSI分析, MSI-H男女比例为11∶20；18例≤65岁, 13例＞65岁；肿瘤分期Ⅱ期19例, 肿瘤分期ⅢA期10例, 肿瘤分期ⅢB期2例；有无癌结节比例为0∶31；有无脉管侵犯比例为3∶28；有无神经侵犯比例为2∶29；有无淋巴结有无转移比例为12∶19；右半结肠9例, 左半结肠3例, 直肠 19例；组织学类型：非黏液癌23例, 黏液癌8例；CEA：26例≤5, 5例＞5。MSIL+MSS的男女比例为46∶61；63例≤65岁, 44例＞65例；肿瘤分期Ⅱ期73例, 肿瘤分期ⅢA期22例, 肿瘤分期ⅢB期12例；有无癌结节比例为7∶100；有无脉管侵犯比例为8∶99；有无神经侵犯比例为3∶104；有无淋巴结有无转移比例33∶74；右半结肠18例, 左半结肠4例, 直肠85例；组织学类型：非黏液癌81例, 黏液癌 26例；CEA：90例≤5, 17例＞5。MSI-H肿瘤在性别、年龄、肿瘤分期、组织学分型、CEA升高与否、肿瘤部位、淋巴结是否转移、神经侵犯与否、脉管侵犯与否、有无癌结节同MSI-L和MSS肿瘤相比, 差异均无统计学意义(P＞0.05)。

2.3 MSI与术后化疗的关系 Ⅱ期MSI-H化疗9例, 未化疗10例；Ⅱ期MSI-L或MSS化疗44例, 未化疗29例。Ⅲ期化疗38例, 未化疗8例。Ⅱ期中MSI-L或MSS患者卡培他滨(希罗达)单药化疗、FOLFOX4、XELOX方案, 5年生存率分别为66.7%(6/9)、57.7%(15/26)、77.8%(7/9), 比较差异无统计学意义(P＞0.05)；Ⅲ期患者希罗达单药化疗、FOLFOX4、XELOX方案,五年生存率分别为27.3%(3/11), 26.1%(6/23), 50.0%(2/4), 比较差异无统计学意义(P＞0.05)。MSI-H 31例, MSI-L、MSS共107例, 两组患者5年无病生存率分别为71.0%(22/31)和44.9%(48/107), 比较差异有统计学意义(P＜0.05)。Ⅱ期MSI-L或MSS患者化疗后5年生存率为63.6%(28/44)明显高于未化疗41.4%(12/29), 差异有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

本次研究中, Ⅱ期中MSI-L或MSS患者中有7例有神经脉管侵犯、癌结节等多种高危因素行化疗, 仅有2例存活高于5年, 1例有高危因素者未化疗。说明Ⅱ期结直肠恶性肿瘤有相关高危因素预后不佳［3-5］。如果去除有该高危因素, 将剩下的Ⅱ期检测为MSI-L或MSS病例进行统计, Ⅱ期MSI-L或MSS患者化疗后5年生存率为63.6%(28/44)明显高于未化疗41.4%(12/29), 差异有统计学意义(P＜0.05)。本研究纳入的化疗方案有三种, 分别为希罗达单药化疗、FOLFOX4、XELOX, 研究显示Ⅱ期和Ⅲ期三种化疗方案间比较, 差异无统计学意义(P＞0.05)。既往研究认为5-FU 联用其他化疗药物时, 会改变 MSI 对化疗药物的预测价值, 尤其是加入 dMMR 结直肠癌敏感的奥沙利铂, FOLFOX 化疗方案的结直肠癌中 MSI 可能是预后良好的一种标志, 尤其是Ⅲ期。但因为本研究中Ⅲ期患者总共有46例, 其中XELOX方案化疗仅4例, 样本量较少, 与相关研究结果不符, 结果不一定客观准确, 需进一步增加样本量, 以作进一步研究。

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