徐红霞，裴瑾，彭成，马云桐，杨梅，吴清华

药用植物种质资源是中医药事业发展的基础，是中药新药、植物药开发、优良品种选育的基因来源。自古以来，药用植物资源是人类使用最多的天然药用资源，据第三次全国中药资源普查的资料统计，我国的药用植物资源11 000余种，分布于385个科，其中种子植物223科，占中国药用植物总数的90 %以上[1]。《中药材保护和发展规划(2015—2020年)》提出建设野生中药材资源保护工程，开展第四次全国中药资源普查，建立全国中药资源动态监测网络，建立中药种质资源保护体系；《中医药发展战略规划纲要(2016—2030年)》提出加强中药资源保护利用，建立国家级药用动植物种质资源库。植物种质资源库是指以植物种质资源为保护对象的保存设施，而低温种质资源库是保存植物种质资源的最佳途径。自1958年美国国家种子贮藏实验室率先建立世界上第一座国家级现代化低温种子库以来，目前全世界已建成各类种质库1700余座，收集了植物种质资源740多万份（含各国重复保存部分），其中约90 %是以种子体的形式保存于全球上千座低温种质资源库中[2]。随后英国的千年种子库、挪威斯瓦尔巴全球种子库相继建立。国家中药种质资源库的建立对确保药材质量，发现新品种及选育良种，保存生物多样性，保障药用资源的可持续利用具有重要意义。随着新技术和新方法的应用，低温种质库保存种质资源的机制也越来越完善，但我国专业性中药（药用植物）种质资源低温库建设工作比较滞后，大多是借鉴农作物资源库的保存体系，其中仍是面临一些问题。本文对目前低温种质资源库保存药用植物种质资源面临的问题进行探讨和分析，并根据目前药用植物种质资源保存的实际情况，提出了改进和完善建议。

1 低温库保存药用植物种质资源的基本情况

种质资源库是以种质资源为对象的贮藏设施，其最大的特点是被保存材料是活体物质。低温种质库的贮藏对象是耐低温、干燥的正常型种子，种子在低温低湿条件下可大大延长其贮藏寿命。低温种质库以贮藏期长短可分为短期库、中期库和长期库。短期库（临时库）库温在15±2 ℃，RH＜50 %，供鉴定、研究和分发用，属临时保存的应用材料；中期库库温在-4±2 ℃（或4±2 ℃），RH＜60 %，储藏寿命5～10年，主要用作分发材料；长期库库温-18±2℃，RH＜60 %，贮藏寿命可达20年以上，任务是长期贮存，一般不作分发用，当分发材料用完时可以用作繁殖材料提取，所以也叫基础库[3～4]。我国药用植物种质资源库建设工作起步较晚，“七五”期间在浙江中药研究所建立的我国首座设计容量为200种计5万份的药用植物种质资源库，使得保护和合理开发利用药用植物种质资源工作迈出了重要的一步，但由于经费原因没有启用[3]。2005年在中国医学科学院药用植物研究所建设的我国首个现代化国家药用植物种质资源库，是我国也是全世界收集和保存药用植物种质资源最多的专业种质库，目前完成入库的野生、栽培药用植物种质近3万份，实现了对193个科1017个属种子的长期保存，保存期为50年[3,5～7]。2012年国家分别在四川和海南启动了国家中药种质资源库，四川库建在成都中医药大学，拟将完成第四次中药资源普查所收集中药种质资源的保存，预计共收集、保存种质资源达5万份，库容量20万份。

2 低温库保存药用植物种质资源面临的问题

2.1 药用植物种质资源库的构建工作难度大

药用植物不同于大田作物，大田作物的产量、品质等经济性较药用植物易于控制。而药用植物作为中药材，除了要考虑其产量外，还要考虑到其有效成分的含量，药用植物的有效成分一般为其次生代谢产物，含量极微[8]。同时，在我国药用植物资源中，栽培品种有300多个，绝大部分为野生资源，受药用植物的药用部位影响，无论是人工种植还是野生的药用植物资源，为满足最适采收期的要求，一般在种子成熟前就已经完成采收，给种质的收集增加了难度[9]。另外，药用植物种质资源带有明显的地域性，中药资源的任何研究都离不开道地性研究，而道地药材是一个约定俗成的概念，对其内在的生物学方面没有详细的阐述。加之药用植物种质资源库的研究及建设工作未受到应有的重视，导致我国药用植物种质资源库的构建工作难度加大，进展缓慢。

2.2 种质低温保存过程中对种质安全保存期缺乏关注

种质保存寿命一般是指种子保存至其发芽率降低至50 %或者完全丧失生活力所需要的时间，而在种质资源保存领域，过低发芽率的种子不具备保存的意义。在常规条件下，种子贮藏生命力周期较短，种子保存的有效性与安全性受到影响，人们开始研究影响种质寿命的原因，探索延长种质寿命的方法[10]。1972年Harrington提出了两条种子寿命通则：在一定温度范围内，贮藏温度每降低5 ℃（温度在50～0 ℃）或种子含水量每降低1 %（含水量在14 %～4 %），种子寿命可延长一倍。联合国粮食及农业组织（FAO）[4]正是基于上述理论基础，提出了种质中长期贮藏的种子含水量和储藏温湿度技术标准。

种质安全保存的含义可以理解为，通过采取有效的保存技术，最大限度地减少种质在贮藏和更新过程中发生遗传漂移，以维持每份种质的遗传完整性。因此，种质资源在保存过程中，需要在种子发芽率降到一定程度时进行繁殖更新。种子从入库保存至其发芽率降低至更新发芽率下限的这段贮藏时间，即为种质的安全保存期。FAO[4]推荐了种质库种质资源更新发芽率的下限标准，即发芽率降至入库初始值的85 %。由此可见，种质的安全保存期比种质的保存寿命短。有关种子保存的研究多数是分析或经过数据模拟种子的保存寿命，而对种质安全保存期几乎没有关注，中药种质资源低温库和常温保存条件下实测获得的安全保存期更是报道罕见。在作物方面，宋超[10]等对水稻和小麦种质资源安全保存进行了研究，研究结果表明，除了与温度、种子含水量等保存条件有关外，种质安全保存期还受诸如种质初始质量、品种类型、遗传特性等因素的影响。然而，种子在长期保存过程中的衰老是不可避免的[11]，因此，种质的安全保存期在种质资源保存过程中不可忽视。所以，在低温条件下种质资源安全贮藏多少年已成为人们高度关注的问题。

2.3 种质低温保存过程中种质的生活力丧失

低温种质库是植物种质资源保存的最主要方式，种子成熟后开始进入衰老过程，即使在目前认为较为安全的种子库（低温低湿）贮藏条件下，种子生活力仍在缓慢丧失。有研究表明，长期库保存的西红柿种子，保存10年后发芽率仍然与初始值十分接近；但洋葱种子，在保存5年后发芽率就降至50%[12]。对国家库贮藏20年以上种子生活力与田间出苗率监测研究中，92.9 %的被监测种子发芽率仍保持在85 %以上，但小麦等6种作物的田间出苗率比入库初始发芽率低20 %以上，而且有8份种子出苗率低于10%[13]。在其他国家种质库中也有类似的报道，例如在美国国家种质库中，780份花生保存34年后平均发芽率从89%降至6 %，3635份大豆种子保存36年后发芽率从起始的92 %降至21 %，427份小麦种子保存43.6年后发芽率从94 %降至73 %[14]。波兰国家植物遗传资源中心保存的4000份冬小麦中，有4 %的种子保存10年后发芽率不足80 %[15]。

而目前有关于药用植物种质资源低温保存过程中生活力丧失的研究比较少。于-10±1 ℃保存的红麻种子，初始发芽率为88 %，31年后种子发芽率仍然在79.7 %以上[16]；而紫云英种子在-1 ℃保存20年后，其发芽率不足初始的50 %[17]。金钺[5]等对国家药用植物种质资源库中期库保存4年的荆芥、黄芩、桔梗、益母草、穿心莲、党参、冬凌草等7种药用植物进行种子生活力的检测，发现种子发芽率均下降，除荆芥、黄芩种子发芽率下降不显著外，降幅为4.9 %和5.4 %，其余5种药用植物的种子发芽率显著下降，降幅分别为8.9 %、12.0 %、12.2 %、14.3 %和17.0 %。因此，低温贮藏只能延缓而不能阻止种子的衰老，且不同品种间的种子生活力丧失的差异非常大。

2.4 种质低温贮藏过程中发生遗传变化，急需制定种质更新标准

种质资源保存的目的是既要保持种子生活力，又要保持其遗传完整性。维持种质的遗传完整性，即是在种质贮藏过程中要保持其最低程度的遗传改变，在繁种过程中要保持子代与亲代具有最大的遗传相似性。因此，种质遗传完整性变化有两方面含义：一是指种质贮藏过程中的遗传变化，如染色体畸变，DNA、RNA等遗传变化，以及所产生的遗传效应；二是指种质繁殖后，其子代种质群体的遗传组成与亲代种质群体相比较发生了变化[18]。然而许多研究报道指出，种质在贮藏过程中会发生遗传上的变化[19～21]。其主要原因：一是贮藏期间老化种子诱导染色体、DNA等发生变化；二是由于种子在贮藏和更新过程中遭受遗传选择，即遗传上异质种子样品中遗传变异性的丧失。

染色体畸变、DNA、RNA等遗传变化在种子衰老过程中是一种普遍现象，它是种子老化作用的结果。葛荣朝[22]等研究结果表明，种子经过长期贮藏，往往会出现染色体畸变率显著升高而发芽率明细降低的现象，而种子在萌发过程中出现的大量异常细胞分裂是造成染色体畸变和发芽率降低的重要原因之一。张晗[21]等研究人工老化的玉米种子，经SSR分析发现，低发芽率群体的多态性条带百分率、等位基因数、有效等位基因数、基因多样性指数、Shannon指数等遗传参数，与对照群体的遗传参数相比都有所下降，表明种子老化处理后群体内的遗传多样性低于对照群体的遗传多样性，群体内遗传变异出现下降。

对于种质资源，FAO推荐的更新标准是85 %，这是因为低的更新发芽率标准会造成以下结果：（1）混合群体中存在着不同基因型，若更新发芽率低，不仅不同存活组分的遗传变化大，而且发生某些基因型丧失的危险性也大；（2）种子的发芽率与种子活力呈正相关性，即低发芽率的种子，其活力也低；（3）在更新过程中，对于群体中存活基因型较差的种子，遭受遗传选择的危险性会增大。但是这种标准对于种质保存的种子可能过高，因为库存种子的起始发芽率通常很高，参照这个标准则可能会导致频繁的繁殖更新。而对于药用植物种质资源在低温保存过程中遗传完整性的报道则近似于无，Jaroslava等[23]研究了经过4到10 次繁殖更新后的豌豆种质遗传变化，遗传完整性有明显的变化，认为即使是自花授粉作物和高度同质性作物，在多次繁殖更新后也面临着丧失遗传完整性的风险[12]。因此，我们需要尽量延长种子的贮藏寿命，以降低频繁更新可能会带来的遗传变异。

更新标准的确定，除了从遗传学基础考虑外，还要考虑种子生活力的丧失特性，尽可能在种子生活力快速下降之前更新。尽管染色体畸变率与种子生活力存在负相关性，但目前的研究仍无法找到种子的生活力临界值水平，在繁殖更新次数和繁殖更新发芽率水平之间找到平衡。因此，加强对种子衰老和遗传完整性的研究，制定适当的种质更新标准是种质库管理者面临的一大难题[12,24]。

3 药用植物种质低温保存改进及策略

3.1 建立和完善药用植物种质资源保存体系

低温种质资源库中，所有贮存种质的外在贮藏条件是相同的，因此，影响种子生活力丧失快慢的因素就取决于种子本身的遗传因子和贮藏前的环境条件。然而种子本身的遗传因子对生活力丧失的影响是无法控制的，所以除种子本身的遗传特性外，贮藏前种子的质量及环境条件是影响生活力丧失的另一重要因素。

研究表明，贮藏寿命会受到许多因素的影响，如物种或品种自身寿命长短，种子生长和收获期间的气候条件，种子收获后的脱粒、干燥及运输，存放以及入库前处理等[25]。分析由不同单位繁种的小麦种子经长期库保存后的生活力差异，发现不同繁种单位提供种子生活力下降快慢不一致，可能是由于繁种地气候等环境差异对种子产生不同的影响[13]。有研究发现高温高湿在大豆种子发育和成熟过程中可以导致种子在收获前就发生劣变[26]。有报道指出，金钱松种子在低温贮藏的最佳含水量在5 %～6 %[27]；川牛膝含水量在5.7 %左右时，其种子活力及抗老化能力较强[28]。而当归种子在阴凉处保存的最佳含水量为2.85 %，并且有利于种子的后熟作用[29]，而根据FAO种质库保存的种子含水量为5～8 %。由此可见，是否制定各种子长期保存的最理想贮藏条件，还有待进一步研究。

因此，种质安全保存工作应从繁种工作开始，充分重视各个环节的质量把关，确保种子发育期、收获期和保存前处理期均处于最佳环境条件，控制种子初始质量和含水量，并采用合适的包装材质、保存温度等[10]，在此基础上建立药用植物种质资源最佳保存体系。

3.2 做好种质生活力监测和更新标准工作

随着种质资源库收集和保存的量越来越多，需要对不同种质定期进行抽样监测，以便更安全的贮藏更多种质和确定各种质繁殖更新时间。药用植物种质资源保护工作起步晚，到目前为止没有系统开展种子生活力监测工作，为确保药用植物种质资源得以长期安全保存，可参照国家库农作物种质资源的保存体系，制定种质生活力监测和更新方案。

首先，增加生活力监测频率，不耐贮藏的种质资源应作为重点监测对象，对生活力整体出现明显下降的某些繁种单位提供的种子，亦应作为重点监测对象。其次，生活力监测应逐份进行，不宜采用抽测方式，并增加活力监测内容[13,22]。再次，确定适宜的种质发芽率更新标准[13]，有研究发现，水稻等作物种子生活力出现快速下降的拐点发芽率水平约为73±2 %，并认为有必要在降至该水平之前更新[30]。因此，对于不同品种的药用植物种质资源，应制定各自的种质发芽率更新标准；开展种子生活力丧失预警指标及无破坏性的种子生活力、活力监测方法的研究，以提高种质衰老的预警能力；开展提高田间出苗率技术与方法研究，尤其是提高野生药用植物种子的出苗率和成苗率等技术的研究[17]。

4 结语

药用植物种质资源是中医药产业的源头，对我国中医药的发展有着举足轻重的作用。因此，药用植物种质资源库的建设，对药用植物种质资源的保存尤为重要，具有长期性和稳定性的优点，其最终目的是保持种子样品的活力、遗传完整性和质量以及使得它们可以利用。但我国药用植物种质资源保存技术开展较晚且建设工作是借鉴于农作物的保存体系，其中依然存在种质健康并长期储藏的问题，如何解决这些问题，还需要广大学者的共同努力。