钱高青，杜冰心，汪竹群，丁艳日，栾少华，柯春林

（蚌埠学院食品与生物工程学院，安徽蚌埠 233030）

单宁是一种来源于植物的多酚化合物，分子量为500～3 000 kDa。尽管单宁具有抗菌活性，但许多微生物对单宁具有一定的抗性，并能在其上生长和发育，微生物通过分泌单宁酶来解除单宁的抑制作用。单宁酶即单宁酰基水解酶，它能够水解单宁酸的酯键产生葡萄糖和没食子酸酯[1]。单宁酶作为诱导酶是由微生物（如细菌、真菌和酵母） 产生的。真菌（如曲霉、青霉）、细菌（如芽孢杆菌、葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、乳酸菌、片球菌） 产生的单宁酶能降解鞣花单宁产生的葡萄糖和没食子酸，然后进入柠檬酸循环。单宁酶在食品和药品工业中有广泛应用，如单宁酶用于啤酒和果汁的澄清[2]，单宁酶处理的绿茶具有较高的抗氧化性能，它能抑制绿茶和红茶中的致癌物质亚硝胺[3]。综述了单宁酶的微生物来源、发酵条件、纯化方法和酶生物技术进展。

1 单宁细菌降解

据报道产酶菌株，如芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和克雷伯氏杆菌等以单宁酸为唯一碳源[4]。产单宁酶，依赖单宁生存的细菌属于抗单宁微生物，这种抗性不受自身种类和地域的限制。细菌如无色杆菌、肺炎克雷伯菌、枯草杆菌、棒状杆菌和链球菌也能有效生产单宁酶。人们已经从人类粪便和植物性发酵食品中分离出产单宁酶乳酸杆菌[5]。存在于食品和肠道中的乳酸菌可以水解单宁，并降低细胞对单宁的吸附能力。此外，许多经常食用的食品饮料和茶叶中含有具有不同药理活性的水解单宁，而且人体消化道存在单宁酶活性的乳酸杆菌能显著影响这些单宁酸的性能。细菌单宁酶大多以没食子酸甲酯为底物，然后产生最终的氧化产物没食子酸。植物乳杆菌通过降解橄榄油厂废水中的高分子量酚类化合物并降低低分子量酚类化合物的产生，从而把单宁酸降解成为单体物质[6]。细菌能够分解一些酚类化合物，如天然的原花青素和原儿茶酸。据报道无色杆菌属中的好氧细菌能够降解没食子鞣质，多黏芽孢杆菌、棒状杆菌和肺炎克雷伯菌能够对质量分数为1%的没食子鞣质进行降解[7]。此外，短小芽孢杆菌、多黏芽胞杆菌和植生拉乌尔菌能够以栗树皮作为碳源底物产生单宁酶，进而降解单宁并释放出没食子酸。但是，短小芽孢杆菌却产生诸如2,3-没食子酸结构的2种中间产物，它们大多数都连有葡萄糖残基。据报道大肠杆菌和棕色固氮菌对单宁有同样的利用率，也即0.65%（W/V）。从制革废水分离出的弗氏枸橼酸杆菌能在高浓度单宁5%（W/V） 的基本培养基中生长[8]。到目前为止，尽管单宁的具体代谢途径还不是很清楚，但是细菌可以通过对单宁的改性、降解、失活和金属离子螯合等途径来消除单宁的抑制作用。

2 单宁真菌降解

与缩合单宁（荆树单宁） 相比，青霉、曲霉、木蹄、猪苓、栓菌在水解鞣质（鞣酸）中生长良好。大多数的制革废水降解真菌为青霉和曲霉。除了这些，从人参、毛发、皮肤中分离的真菌包括毛壳霉、镰刀菌、立枯丝核菌也具有降解制革废水污染物的能力[9]。在这个降解过程中，中间体（如顺乌头酸、α-酮戊二酸和柠檬酸）也被释放。除了儿茶素，烟曲霉在6～8 d内能把单宁分解为没食子酸。有研究表明，青霉类和曲霉利用儿茶素、没食子和没食子酸为碳源产生单宁酶[10]。在各种真菌系统中，单宁的降解被认为是迅速存在的碳源补充剂。国外学者已经对产黄青霉分解单宁酸和没食子酸的生长动力学如温度、pH值和碳源进行了研究。真菌，如烟曲霉菌、黑色消化球菌和海绵共生真菌能够降解单宁为草酸[11]。黑曲霉、黄曲霉和米曲霉产胞外酶，并以单宁酸作为有效的（氮）碳源。很明显，以上的研究证明，单宁酶是一种诱导酶。在现有的微生物酶中，曲霉属真菌产生的酶是最有潜力和商业生产前景的。有些真菌（如曲霉、青霉）通过单宁降解系统抵抗高浓度单宁[11]。有研究显示，微生物固态发酵（SSF）产生的单宁酶活性要比深层发酵（SMF）产生的酶活性的效价高[12]。尽管在SSF中不同的生理原因尚不完全清楚，但是有许多关于SSF产酶行为差异的几种理论，合理的解释是由于底物浓度梯度的形成和及时去除产物的作用，从而影响酶生产。

3 单宁酶及其性质

为了利用不同类型的底物，由于协同作用，自然环境中的微生物需要分泌酶、碳水化合物和酯类化合物的结合物。只要培养基含有少许酚类化合物底物，微生物就能生产胞内和胞外酶复合物。结果这种生物酶的抑制作用减少了微生物的生长，并延缓有机质的分解。随着2，3，4，6四没食子酰葡萄糖和2个其他类型的单没食子酰基葡萄糖的出现，单宁酸完全水解为没食子酸和葡萄糖[13]。除了单宁酸外，单宁酶能加强甲基没食子酸酯、没食子酸乙酯、没食子酸丙酯和没食子酸没食子酸酯的裂解。对不同的单宁底物，所有微生物来源的单宁酶的活性是有差异的。来自真菌和酵母的单宁能较好地降解水解单宁，但不能分解天然的鞣质单宁[7]。细菌单宁酶的性质是多变的，这种差异取决于产单宁酶的微生物本身。细菌单宁酶的分子量为46.5～90 kDa。来自黑曲霉的单宁酶是一种糖蛋白，分子量约为186 kDa。通过麦麸固态发酵，已经分离到黑曲霉ATCC 16620胞外酶，但是该酶需要进一步纯化才能弄清其结构、功能关系和生化特性[14]。

4 产单宁酶发酵条件

采用多种不同发酵方式，微生物单宁酶的产量可以得到提高。例如，通过黑曲霉的表层培养[15]和米根酶的固态发酵，其产酶量都能得到提高[16]。在30℃和pH值6.6条件下，在查氏基本培养基中添加2%的单宁酸和0.2%的葡萄糖，酶的产量可提高1.13倍。塔拉黑曲霉产单宁酶的最适温度是60℃，但LCF8黑曲霉产酶的最适温度是35℃[17]。米曲霉、曲霉属、桔青霉产单宁酶的最适温度范围为30～40℃[18]。从植物乳杆菌CECT 748 T中分离的单宁酶的最适温度为30℃，而且在50℃仍然具有75%的酶活。有报道说，钾离子能提高黑曲霉产酶活性，钙离子和锌离子抑制能抑制其产酶活性[19]。植物乳杆菌CECT 748在30℃时酶活性最高，为6.26 U/mL[20]。产单宁酶的菌株（如米曲霉、黄青霉和黑曲霉产酶） 的最佳温度为30～40℃，pH值为5[21]。深层发酵中，温度为30～33℃，初始pH值为3.5～6.5，黑曲霉属产单宁酶的产量能够得到提高[15]。

5 单宁酶纯化

单宁酶纯化取决于市场、加工成本、最终的质量和可用的技术。大规模、成本有效的蛋白纯化方面的需要导致技术变革，要求在较少的处理步骤中能提供快速、高效和经济的手段。商用单宁酶一般需要纯化，但在废物处理行业中应用单宁酶的纯度要求并不高[22]。单宁酶纯化后，其催化性能和稳定性都得到提高，而且能防止不必要反应的发生。目前，已有关于微生物来源单宁酶的纯化以及酶特性分析的报道。纯化不仅仅是一个特有的方法，它也是一项综合的技术，纯化后黑曲霉产单宁酶的产量可从2.9%增加到50%[23]。这在各种食品、饲料、皮革、酿酒、制药行业的应用，以及亲和层析技术中也有相关的报道。通过超滤、高效液相色谱、电泳等纯化技术可得到高纯度的酶[24]。然而，这些处理过程费用高，同时产量也很低。而且因此这些方法获得的纯化酶丢失了部分活性，不适合生化研究。纯化中，酶的纯度固然重要，但费用低而且快速的纯化过程也是必要的。文献报道酶的纯化步骤包括一系列过程，即蛋白沉淀和随后的离子交换或凝胶过滤色谱层析[25]。细胞外单宁酶的纯化可以通过2种色谱法，即G-150葡聚糖凝胶层析柱层析和DEAE-纤维素离子交换色谱层析，据报道葡聚糖凝胶柱凝胶150能分离出单宁酶的2种异构体（TAH I，TAH II）。

6 单宁酶的克隆和表达

重组DNA技术为转基因微生物的生产酶提供了新机遇。由于使用传统技术生产单宁酶遇到了难题，因此分子生物学技术被用于单宁酶的生产中，采用重组微生物技术可提高酶产量。有研究通过对单宁酶基因CECT 748 T进行克隆，利用pUR13载体表达，然后进行酶的纯化。在T7 RNA聚合酶诱导调控下，该酶基因的功能也被确定并在大肠杆菌中得到表达。由于克隆重组植物乳杆菌单宁酶蛋白质具有6个亲和性高的组氨酸序列，通过反义引物在DNA聚合酶作用下扩增，植物乳杆菌SN35N单宁酶编码基因被克隆到质粒pGEM-T上，然后在大肠杆菌BL21中得到表达。据报道，有研究者已经开发出与结肠癌有关的产单宁酶细菌，而且能鉴别了该产单宁酶细菌基因。据报道，来自芦柑的pT Ztan18核苷酸序列（AB244239） 为6 994 bp，假设每个ORF能够编码多肽，它有3个开放阅读框（ORF）。ORF1，ORF2和ORF3分别编码635，643和613个氨基酸残基。其中，在添加酵母提取物的脑心浸液中，ORF3具有一个很明确的功能区域，它被命名为Tan A。由于芦柑Tan A的独特性，它已被用于Southern印迹杂交和PCR技术中。因此，Tan A被用作快速检测芦柑的生物标记基因。在现有的细菌、真菌和酵母菌种，单宁酶的核苷酸和氨基酸序列表现出相似性。此外，肠细菌和单宁酶可用于保护放牧的草食动物和环境免受单宁的毒性作用。肠杆菌属单宁酶约1 410 bp组成，编码469个多肽氨基酸残基。据报道，人们已经从葡萄球菌、植物乳杆菌中克隆出单宁酶基因。

7 来自宏基因组文库的单宁酶

然而，这些方法主要限于可培养的微生物，对于那些具有产单宁酶潜力的不可培养微生物并不一定适用。研究人员现在正在采用宏基因组学的方法鉴定并开发不可培养微生物的单宁酶基因。到目前为止，传统的技术仅仅注重可培养微生物的单宁酶基因，通过宏基因组学文库分离单宁酶基因可克服此缺点。因为在没有微生物实验室培养的条件下，宏基因组学的方法可以寻求工业应用上需要的新的功能酶。据报道，宏基因组技术分离的单宁酶Tan 410能够固定各种支持物，如石英SBA-15、壳聚糖、海藻酸钙和离子交换树脂IRC50。同常规的单宁酶相比，这些酶的耐热能力可提高500～1 000倍。此外，在包埋一个月的最佳反应条件下，它仍然可以保持95%的初始酶活性。目前，已经从棉花样品中宏基因组文库分离出独特的单宁酶基因Tan 410。通过SDS-PAGE和凝胶过滤层析的序列分析，该酶由521氨基酸残基组成，是分子量为55 kDa的单体酶。该酶在pH值为6.4，温度为30℃条件下能活化。通过序列对比分析，单宁酶Tan 410基因编码一个全长为1 536 bp的ORF，其具有很好的耐盐性，在4 mol/L氯化钠条件下很稳定，在5 mol/L氯化钠环境中仍然能保留80%的活性。另外，来自蜡样芽胞杆菌的与Tan 410特性类似的单宁酶可用来作为制革厂污水理想的净化剂。除了单宁酸外，HPLC分析表明在40 min内，Tan 410具有水解不同底物的能力，如表儿茶素、没食子酸酯、表没食子儿茶素、阿魏酸乙酯、迷迭香酸和绿原酸。

虽然单宁酶在饮料、食品、饲料以及制革废水净化方面有一定应用，但工业生产单宁酶的成本高。因此，单宁酶基础和应用方面的研究更值得关注，如酶的调控、新的表达系统、利用大规模培养技术设计新的生物过程、高效经济的下游加工技术、单宁酶应用的新设计。此外，应该通过宏基因组学方法和蛋白质工程开发新型单宁酶。这样可能寻找到具有独特性能的、适用于各种工业应用的单宁酶。